Биохимические показатели крови человека при сальмонеллезной интоксикации

Реферат.

       Дипломная работа на тему: «Биохимические  показатели  крови  человека
при сальмонеллезной интоксикации»  содержит  46  страниц  печатного  текста,
таблиц, 8 рисунков, 59  использованных  источников  литературы,  из  них  10
иностранных.

       Перечень ключевых слов: сальмонеллез, перекисное  окисление  липидов,
циркулирующие  иммунные  комплексы,  каталаза,   молекулы   средней   массы,
сывороточный альбумин, эндогенная интоксикация.

       Объект исследования: сыворотка крови  практически  здоровых  людей  и
больных сальмонеллезом г. Пензы.

       Практическое применение: в здравоохранении.



                             Список сокращений.

ПОЛ – перекисное окисление липидов;
ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы;
ЧСА – человеческий сывороточный альбумин;
МДА – малоновый диальдегид;
ПЭГ – полиэтиленгликоль;
АОС – антиокислительная способность;
АТ – антитело;
АГ – антиген;
ИК – иммунный комплекс;
ЛПС – липополисахаридный комплекс;
МСМ – молекулы средней массы;
ТБК – тиобарбитуровая кислота;
ЭКА – эффективная концентрация альбумина;
ОКА – общая концентрация альбумина;
ТХУ – трихлоруксусная кислота;
ЦНС – центральная нервная система;
ц-АМФ – циклический аденозинмонофосфат;
АФК – активные формы кислорода;
LOOH, HOOH – гидроперекиси;
СОД – супероксиддисмутаза.



                                 Содержание.

|Введение………………………………………………………………..                                 |5-6    |
|                                                                   |       |
|Обзор литературы ………………………………………………...                             |7-19   |
|Биохимическая характеристика интоксикации при сальмонеллезной      |       |
|инфекции…………………………..……..                                           |7-11   |
|Молекулярные механизмы развития эндогенной                         |       |
|интоксикации при сальмонеллезе……………………..…..                        |11-14  |
|Показатели уровня эндогенной интоксикации                          |       |
|организма при сальмонеллезе……………………………….                           |14-19  |
|                                                                   |       |
|Материалы и методы исследования………………………….                         |20-25  |
|Материалы исследования…………………………………….                              |20     |
|Методы исследования…………………………………………                                |20-25  |
|                                                                   |       |
|Результаты и обсуждение………………………………….……                            |26-34  |
|Определение показателей уровня интоксикации в                      |       |
|сыворотке крови практически здоровых людей……..                     |26-27  |
|Определение показателей уровня интоксикации в                      |       |
|сыворотке крови больных сальмонеллезом………….…..                     |28-34  |
|                                                                   |       |
|Список использованных источников……………………….…..                      |35-40  |
|                                                                   |       |
|Выводы………………………………………………………………….                                   |41     |
|                                                                   |       |
|Приложения…………………………………………………………….                                 |42-46  |

                                  Введение

       Успехи  в  борьбе  с  инфекционными  заболеваниями  в  нашей   стране
общепризнанны. Вместе с тем в инфектологии еще  остаются  проблемы,  имеющие
серьезное социально-экономическое значение для всех стран мира. К  их  числу
относятся острые кишечные инфекционные заболевания [1].
       Сальмонеллез  –  группа  острых   кишечных   инфекционных   болезней,
вызываемых  бактериями  рода  Salmonella,   характеризующихся   значительным
полиморфизмом   клинического   течения,   частым   наличием    интоксикации,
лихорадки, признаков поражения желудочно-кишечного тракта [2].
       Крупные  достижения  отечественных   и   зарубежных   исследователей,
установивших патогенетическое  значение  нарушения  биологической  регуляции
при острых кишечных инфекциях, дали  новый  импульс  в  изучении  патогенеза
сальмонеллеза [3].
       Иммунная система представляет собой сложную многокомпонентную систему
из быстроделящихся и покоящихся клеток. Она является высокочувствительной  к
воздействию токсинов бактерий. Это приводит к  нарушению  иммунорегуляторных
процессов.
       Наиболее информативными являются показатели состояний  прооксидантно-
антиоксидантного равновесия,  которое  при  усилении  действия  на  организм
токсинов смещается в сторону активизации ПОЛ, уровня холестерина,  ЦИК,  Ит,
МСМ.
       ПОЛ  –  это  фундаментальный  универсальный  молекулярный   механизм,
лежащий в основе устойчивости  и  адаптационных  возможностей  организма.  В
норме ПОЛ обеспечивает условие для жизненно важных функций клетки, в  случае
же интоксикации становится пусковым механизмом  патобиохимических  изменений
в организме человека.
       Целью  моей  дипломной   работы   является   изучение   биохимических
показателей эндотоксикоза в  динамике  патологического  процесса.  В  задачи
исследования входило:
   1.  Определение содержания  МДА,  уровня  холестерина,  ЦИК,  Ит,  МСМ  и
      активности каталазы в группе контроля, которую  составили  практически
      здоровые люди.
   2.  Определение содержания  МДА,  уровня  холестерина,  ЦИК,  Ит,  МСМ  и
      активности каталазы у больных сальмонеллезом.
   3.  Исследование изменения изучаемых показателей у больных в  зависимости
      от степени тяжести заболевания.



           1. Обзор литературы

                1. Биохимическая характеристика интоксикации при
                   сальмонеллезной инфекции

       Сальмонеллезы принадлежат к числу  инфекционных  заболеваний,  весьма
широко   распространенных   на   всех   континентах    мира.    Возбудителем
сальмонеллезов являются микроорганизмы,  принадлежащие  к  роду  Salmonella,
семейства кишечных Enterobacteriaceae.
       Сальмонеллы  –   это    мелкие    бактерии    вытянутой    формы    с
закругленными  концами  длиной  от  1  до  3  и  диаметром 0,5-0,8 нм [4].
       Сальмонеллез  встречается  чаще  у  жителей  городов,  чем  сел,  что
связывается с лучшей  регистрацией  заболеваемости,  наличием  множественных
детских   учреждений,   широким   употреблением   пищевых    полуфабрикатов.
Заболевание отмечается круглый год, но максимальное число  регистрируется  в
теплое время года,  что  объясняется  благоприятными  условиями  размножения
сальмонелл в пищевых продуктах и реализации инфекции [5].

                                                              Таблица 1.1.1.
           Статистические данные больных сальмонеллезом г. Пензы.
|Год    |Количество      |На 100 тыс.   |Кол-во больных    |На 100 тыс.   |
|       |больных         |населения, %  |Пензенской        |населения, %  |
|       |г. Пензы        |              |области           |              |
|1996   |187             |34,9          |362               |23,1          |
|1997   |140             |26,1          |316               |20,3          |
|1998   |230             |43,0          |448               |28,8          |

       В возникновении сальмонеллеза ведущую  роль  играют  живые  бактерии,
гибель   которых   в    организме    больного    сопровождается    развитием
эндотоксинемии.   Принято   выделять   два    вида    токсичных    продуктов
жизнедеятельности микробов-экзотоксии и эндотоксии. К экзотоксинам  отнесены
токсичные  продукты  жизнедеятельности   бактерий,   активно   (при   жизни)
секретируемые в окружающую  среду,  а  к  эндотоксинам  –  те  ядовитые  для
макроорганизма продукты жизнедеятельности, которые освобождаются только  при
лизисе микробной клетки [6].
       Кроме токсина палочка имеет ряд антигенов клеточной стенки. О-антиген
расположен  на   поверхности   микробной   клетки   и   представляет   собой
фосфолипидно-полисахаридный комплекс, включающий 60 % полисахарида, 20-30  %
липида  и   3-4,5   %   гексозамина.   Н-антиген   определяется   жгутиками.
Поверхностные  антигены  клеточной  стенки   провоцируют   типоспецифический
антительный ответ, а глубинные – видоспецифический [6,7].
       При  сальмонеллезе   развитие   и   тяжесть   симптомов   обусловлены
интоксикацией и обезвоживанием.  По  мнению  А.Ф.  Билибина  интоксикация  –
явление сложное, сводящееся к изменению  нервнорефлекторной  деятельности  и
гуморальной регуляции с обменными сдвигами. К.В.  Бунин  в  основу  синдрома
интоксикации ставит воздействие токсина на :
   1) падение артериального давления, снижение  сократительной  способности
      миокарда;
2)  гормональную регуляцию водно-солевого обмена с  изменениями  биосинтеза
   гормонов в коре надпочечников с угнетением процесса их метаболизма;
3)  функцию почек (снижение клубочковой фильтрации,  повышение  канальцевой
   реабсорбции воды, снижение концентрации очищения мочевины) [8].
       Сальмонеллезная  интоксикация  возникает  как   результат   патологии
первичного ответа на инфекционный агент вследствие значительных потерь  воды
и электролитов с рвотой и жидким стулом. По мере увеличения дефицита воды  и
электролитов на первый план выступают  симптомы  обезвоживания  и  поражения
ЦНС.  Если  процесс  прогрессирует,  обезвоживание   нарастает,   появляются
признаки недостаточности  кровообращения,  которые  при  интоксикации  имеют
клинику шока. Частая рвота и понос – первые признаки интоксикации [9].
       Обязательным условием развития заболевания являются наличие  большого
количества возбудителей и их токсинов, массовое  проникновение  антигенов  в
кровь. Наибольшей токсичностью  отличается  липид  А,  вызывающий  следующие
основные реакции: активацию  лейкоцитов  и  макрофагов,  стимуляцию  выброса
эндогенного    пирогена,    антогониста    глюкокортикоидов,    интерферона,
интерлейкинов, подавление тканевого дыхания, активацию системы  комплемента,
тромбоцитов, факторов свертывания крови другие [10,11], [рис. 1.1.1].
       Главной  причиной  развития  шока  при  сальмонеллезе  считается   не
повреждающее действие самих микробов или их токсинов, а  своеобразный  ответ
организма  на  них.  Под   токсико-инфекционным   шоком   следует   понимать
экстремальное  состояние  организма,  наступающее  в   результате   действия
токсичных субстанций возбудителей, патогенных иммунных комплексов на  органы
и ткани организма, сопровождающееся  острым  нарушением  метаболизма  в  них
[12].
                 Схематическое изображение липополисахаридов
                              стенок микробов.



                                 Рис. 1.1.1.

       С.А. Степанов с помощью  аспирационной  биопсии  обнаружил  в  тонкой
кишке  больных  сальмонеллезом   изменение   эпителия,   острое   воспаление
слизистой оболочки, нарушение микроциркуляции  и  сосудистой  проницаемости.
К.Х. Ходжаев в эксперименте на крысах показал, что сальмонеллезная  инфекция
вызывает нарушение процесов тканевого дыхания и фосфорилирования.  Состояние
поджелудочной  железы  изучено  Белянской  Т.А.  В  острый  период   болезни
отмечено снижение ферментативной активности панкреатического сока –  уровень
трипсина был снижен в 71 % случаев, липазы в 55 %, амилазы – в 66 %.
       Таким образом эндотоксин вызывает активацию синтеза,  преимущественно
протеолитических ферментов,  задержку  экструзии  секретируемых  проэнзимов,
что  приводит  к  секреции  и  поступлению  ферментов  в   лимфатическое   и
кровеносное русло [13,14].
       При сальмонеллезе развивается  обезвоживание,  обусловленное  потерей
внеклеточной жидкости, а при тяжелом течении заболевания и части  клеточной.
Дегидратация в большинстве случаев имеет изотонический  характер,  сочетаясь
с развитием сгущения крови, дефицитом электролитов, метаболическим  ацидозом
в капиллярной и венозной крови [15], [рис. 1.1.2].

                2. Молекулярные механизмы развития эндогенной
                       интоксикации при сальмонеллезе

       Явления   интоксикации   вызывают    заболевания,    сопровождающиеся
повышенным   распадом    тканей,    усиленными    процессами    катаболизма,
недостаточностью   функции   печени    и    почек,    снижением    процессов
микроциркуляции [16].
       В  ответ  на   действие   первичного   патогена,   которым   являются
эндотоксины, сальмонелл, в организме развиваются типовые каскадные  реакции,
что лежит в основе современной концепции СЭИ.
       На Международном симпозиуме в Санкт-Петербурге  (1994  г)  было  дано
определение  этого  синдрома  как  клинического   синдрома   с   проявлением
симптомов  интоксикации  при  патологических  состояниях   неоднородных   по
этиологии и обуславливающих накопление в тканях  и  биологических  жидкостях
организма продуктов  патологического  обмена      веществ,      метаболитов,
 деструкции клеточных  и  тканевых  структур,  разрушения  белковых  молекул
[17,18].

Шано   В.П.   с   соавторами   подчеркивает,   что    токсическое    влияние
липополисахаридной субстанции эндотоксина проявляется комплексом  нарушений,
обусловленных повреждением как  циркулирующих  клеток  в  кровотоке,  так  и
эндотелиоцитов,  эозинофилов,  нейтрофилов,  макрофагов,   следствием   чего
является выброс в кровоток ряда биологически активных веществ  –  цитокинов,
интерлейкинов.    Главной    точкой    приложения    эндотоксина    являются
эндотелиальные клетки, активация их приводит к высвобождению  простациклина,
выделению эластазы, токсических метаболитов  кислорода,  факторов  активации
тромбоцитов  и  комплемента   с   высвобождением   терминального   комплекса
комплемента, брадикинина с  последующим  формированием  синдрома  повышенной
проницаемости капилляров.  Это  приводит  к  тому,  что  в  очаг  воспаления
начинают входить компоненты крови, прежде  всего  фибриноген  и  тромбоциты.
Фибрин  способствует  агрегации  тромбоцитов,  полимеризации  фибрина  и   –
возникновению    тромбов.    Следствием    тромбоза    являются    нарушения
микроциркуляции  с  последующей  гипоксией,  что   приводит   к   дальнейшим
повреждениям клеток в очаге  воспаления.  Метаболическим  результатом  этого
является изменение аэробного метаболизма клеток  на  анаэробный,  повышенное
продуцирование лактата и протонов, снижение показателей рН [19].
       Среди  тканевых  (клеточных)  медиаторов  воспаления   важное   место
занимают    простагландины.    Исходными    продуктами    для     биосинтеза
простагландинов   являются   ненасыщенные   жирные    кислоты:    линолевая,
арахидоновая,   пентаноевая.   Наибольшее   значение   имеет   в   организме
арахидоновая кислота, которая содержится в фосфолипидах клеточных мембран.
       Простагландины вызывают  сильное  диуретическое  и  натрийуретическое
действие, оказывают разнообразное действие на желудочно-кишечный тракт.  Они
могут стимулировать и тормозить сокращение и секреторную  активность  тонкой
кишки,  тормозят  секрецию  соляной  кислоты  слизистой  оболочки   желудка.
Простагландины вызывают  секрецию  воды  и  электролитов  в  просвет  кишки,
вызывая диарею, повышают концентрацию  ц-АМФ  в  слизистой  оболочке  тонкой
кишки, влияют на прочность и упругость эритроцитарной мембраны [20, 21,  22,
49].

                3. Показатели уровня эндогенной интоксикации
                         организма при сальмонеллезе

       Анализируя данные литературы за последние десятилетия, можно сказать,
что основными показателями  интоксикации  при  сальмонеллезе  являются  ПОЛ,
уровня холестерина,  ЦИК,  ИТ,  МСМ  и  активность  каталазы.  При  развитии
интоксикации  на   фоне   сальмонеллеза   происходит   активный   хемотаксис
нейтрофиллов в очаг воспаления, где они поглощая  и  переваривая  чужеродный
агент,   изменяют   свою   метаболическую    активность,   характеризующуюся
усилением   поглощения   кислорода,   повышенной   утилизацией   глюкозы   и
гиперпродукцией АФК ([pic]) [23, 24].
       Перекисное окисление является универсальным механизмом взаимодействия
кислорода со многими органическими субстратами,  в  том  числе  с  липидами.
Внедрение кислорода в молекулы окисленного субстрата приводит к  образованию
реакционно-способных  промежуточных   продуктов   –   свободных   радикалов,
гидроперекисей, которые в дальнейшем  вызывают  повреждение  других  классов
соединений – белков, нуклеиновых кислот, углеводов (рис. 1.3.1).

                 Метаболизм супероксидного радикала в норме
                   и при патологии (Владимиров Ю.Я., 1998)



                                 Рис. 1.3.1.

       Накопленные к настоящему времени данные литературы позволяют  сделать
вывод о том, что свободнорадикальное окисление липидов  при  сальмонеллезной
инфекции играет определенную патогенетическую роль [25, 50].
       Установлено,  что  при  развитии  ПОЛ   в   биомембранах   понижается
содержание  легкоокисляемых  полиненасыщенных  жирных  кислот  и  изменяются
физико-химические свойства: микровязкость, текучесть, мембранный  потенциал,
полярность  внутренних  областей   мембран.    Таким   образом,   изменяются
транспортные свойства мембраны и активность ферментов [26].
       Регуляция  свободнорадикального  окисления  обеспечивается  в  клетке
системой  антиоксидантной  защиты.  Так,  накапливающаяся  в  процессе   ПОЛ
перекись водорода обезвреживается  с  помощью  каталазы,  присутствующей  во
всех  тканях  организма.  Каталаза   (КФ   1.11.1.6.)   представляет   собой
гемсодержащий фермент с молекулярной массой около 250000  Д,  локализованный
в пероксисомах клеток [27].
       Митохондриальная каталаза  участвует  в  оксидазном  пути  окисления,
сопровождающемся запасанием энергии  в  виде  АТФ.  Блокирование  транспорта
электронов  в  дыхательной  цепи  приводит  к  стимуляции  пероксисомального
окисления. При потологиях, связанных с нарушением энергетических  процессов,
каталаза пероксисом может выходить из  них  и  участвовать  в  окислении  на
мембранах эндоплазматического ретикулума [28, 53].
       В работе Л.Б.  Оконенко  с  соавторами  о  состоянии  антиоксидантной
системы судили по активности СОД, глутатионпероксидазы  и  каталазы,  анализ
данных выявил дефицит антиоксидантов [29, 30].
       При инфекционном токсикозе в мембранах  эритроцитов  резко  снижается
содержание  общих  фосфолипидов,  но   увеличивается   количество   НЭЖК   и
лизофосфотидилхолина,  что  косвенно  указывает  на   повышение   активности
фосфолилаз,  которые  избирательно  разрушают  липиды  мембран.   Холестерин
подвергается как активному, так и пассивному обмену в мембранах  эритроцитов
[29].   Фермент   лецитинхолестеролацил   трансфераза    превращает    эфиры
холестерина  в  свободный  холестерин  и  тем   самым   регулирует   уровень
свободного холестерина  в  плазме,  что  способствует  проникновению  его  в
мембраны. Следовательно, инактивация этого фермента  в  результате  гипоксии
при эндотоксикозе ведет к повышению уровня эфиров  холестерина  в  мембранах
эритроцитов [31,32].
       Наряду с уровнем МДА, активности каталазы и  уровня  холестерина  для
диагностики  заболевания  и   его   прогноза   имеют   значение   и   другие
неспецифические показатели – ЦИК, Ит, МСМ.
       Синтезирующиеся при формировании  иммунитета  специфические  антитела
обладают способностью взаимодействовать  с  антигенами  возбудителей  и  тем
самым вызывать нейтрализацию патогенных микробов и их токсинов. Эта  реакция
сопровождается образованием иммунных комплексов антиген – антитело [33,  34,
54, 55].  При  патологических  состояниях  образование  ИК  выходит  из  под
контроля, в результате  чего  развивается  та  или  иная  болезнь  ИК  [рис.
1.3.2.].

                Патогенетические механизмы болезней иммунных
                        комплексов (Сура В.В., 1987)


                                 Рис. 1.3.2.

       В  результате  развития  эндотоксемии  при   сальмонеллезе   организм
длительное время контактирует с  избытком  АГ  как  экзогенного  (компоненты
микробных клеток), так и эндогенного (компоненты разрушенных  клеток  самого
организма)  происхождения.  Вместе  с  тем  наблюдается  угнетение   системы
комплемента, ответственного за  лизис  микробных  клеток.  В  этих  условиях
значительного избытка АГ и недостаточности выработки  АТ  может  привести  к
образованию ИК, которые  способны  откладываться  в  определенных  тканях  и
вызывать  острые  воспалительные  реакции.   При   значительных   отложениях
наблюдаются функциональные и морфологические повреждения  органов  и  тканей
[35].
       Связываясь с клеточной мембраной ЦИК вызывают выделение в  окружающую
среду  протеолитических  ферментов  и  основных   пептидов.   Эти   вещества
повреждают  протеогликановые  компоненты  тканей,  действуют  на   базальную
мембрану и вызывают некроз эндотелиальных клеток [36].
       ЦИК наряду с продуктами ПОЛ вызывают нарушение проницаемости мембран,
вплоть до их разрыва, что в конечном итоге может привести к  гибели  клетки.
В  результате  появляются  различные  вещества  пентидной  природы.  Из  них
наибольший интерес представляют молекулы средней массы.
       Являясь олигопептидами с молекулярной массой  300-5000  Дальтон,  они
расцениваются как универсальный критерий эндогенной  интоксикации  и  влияют
на ее уровень и прогноз [37, 38].
       МСМ образуются в организме под воздействием  повреждающих  эндогенных
или  экзогенных  факторов   различного   генеза,   являются   промежуточными
продуктами протеолиза. [39, 57].
       Пристальное  внимание  исследователей  к   МСМ  объясняется   высокой
биологической  активностью  их   отдельных   фракций,   которые   ингибируют
гликолиз, глюконеогенез, пентозный  цикл,  синтез  гемоглабина,  нуклеиновых
кислот,  мембранный  транспорт,  дагоцитов,   эритропоэз,   микроциркуляцию,
обладают  иммунодепрессивным,   цитотоксическим,   нейро-   и   психотропным
свойствами.  Сейчас,  квалификационная  оценка  степени  тяжести   состояния
больных при сальмонеллезе немыслима без определения МСМ [40].
       Установлено, что значительная  часть  циркулирующих  в  крови  СМ  не
только растворена в  плазме крови, но и  связана с альбумином.
       Человеческий сывороточный альбулин  (ЧСА)  –  важнейший  транспортный
белок, осуществляющий  перенос  эндогенных  метаболитов  и  ксенобиотиков  в
плазме крови, межклеточной жидкости, в лимфе.
       Универсальность   транспортной   функции   ЧСА   обеспечивается   его
уникальной способностью  связывать  лиганды  различной  химической  природы.
Интенсивная лигандная нагрузка молекул альбулина  приводит  к  изменению  их
структуры  и  связывающей  способности.  Такие  модификационные  формы   ЧСА
обнаруживаются при патологии [41].
       О величине токсического действия вредных веществ можно судить по ЭКА,
которая  снижается  после  того,  как  токсические  вещества  займут  центры
связывания в молекуле альбулина, что приводит  к  снижению  детоксикационных
свойств организма.  Изучение  свойств  альбулина  является  важным  с  точки
зрения как диагностики, так и лечения [42].



                 2. Материалы и методы исследований

                      1. Материал исследований

       Уровень  интоксикации  оценивался  по  изменениям  в  крови   больных
эффективной  и  общей  концентраций  сывороточного   альбулина,   малонового
диальдегида, как одного из продуктов ПОЛ, уровня  холестерина,  ЦИК,  МСМ  и
активности каталазы.
       Для всех исследований бралась сыворотка крови. Исследовано 30 больных
сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет. Для  контроля  набиралась  группа
51 человека разного пола в возрасте от 20 до 46 лет.
       Кровь бралась из локтевой вены, преимущественно натощак в  количестве
не менее 5 мл. Центрифугируем 1500 об/мин 10 минут. Для выполнения  анализов
сыворотки необходимо использовать сразу или заморозить  и  хранить  при  t=-
20[pic]С.

                           2. Методы исследований

              2.2.1. Определение МДА с тиобарбитуровой кислотой
                            (Конюхова В.С., 1989)

       Об изменении интенсивности ПОЛ судим по изменению  уровня  вторичного
продукта ПОЛ – малонового диальдегида.
       Метод основан на том, что при высокой температуре в кислой среде  МДА
реагирует с  2-ТБК,  образуя  окрашенный  розовый  триметиновый  комплекс  с
максимумом поглощения при 535 им.
       Ход работы: К 0,2 мл сыворотки крови добавить 0,2 мл дистиллированной
воды,  1 мл 0,6 %  ТБК  в  ледяной  уксусной  кислоте.  Кипятить  30  минут,
охладить и добавить 1 мл 5№ КОН и  2  мл  изопропанола.  Центрифугируют  при
6000 об/мин 20 минут. Колориметрируют при 535 нм и 580 нм  против  контроля,
содержащего вместо плазмы воду.
       Расчет:   [pic]   (мкМоль/л),   где   Е   –   оптическое   поглащение
изопропилового экстракта; 106 – коэффициент пересчета оптической плотности.
       Пример расчета: больной Максимов С., 19 лет
       [pic]
       концентрация МДА = [pic] (мкМоль/л).

                   2.2.2. Определение активности каталазы
                            (Королюк М.А., 1988)

       Метод основан на способности перекиси водорода образовывать с  солями
молибдена стойкий окрашенный комплекс.
       Ход определения: Реакция запускается  добавлением  0,1  мл  сыворотки
крови к 2 мл 0,03 % раствора перекиси  водорода.  В  холостую  пробу  вместо
сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию  останавливают  через
10 минут добавлением  1  мл  4%  молибдата  аммония.  Интенсивность  окраски
измеряют на спектрофотометре при  длине  волны  410  нм  против  контрольной
пробы, в которой вместо перекиси водорода вносят 2 мл воды.
       Расчет: [pic] (мкат/л), где
Е – активность каталазы в мкат/л;
А – оптическая плотность холостой и опытной проб;
V – объем вносимой пробы, 0,1 мл;
t – время инкубации, 600 сек;
К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный [pic].
       За единицу активности  каталазы  принимают  то  количество  фермента,
которое участвует в превращении 1 мкат перекиси водорода за  1  секунду  при
заданных условиях. Расчет активности каталазы ведут на 1 л сыворотки крови.
       Пример расчета: больной Крайнов Т.В., 31 год.
       [pic]
       [pic]
       [pic] (мкат/л)

   2.2.3. Определение общего холестерина в сыворотке крови ферментативным
                              методом «Фотокол»
                           (Творогова М.Г., 1995)

       Определение основано на сопряженных  реакциях,  которые  катализирует
холестеринэстераза, холесериноксидаза и пероксидаза:
       Эфиры холестерина [pic] холестерин + Ж.К.;
       Холестерин + О2 [pic] холестинон + Н2О2;
       Н2О2 + хромогены [pic] Н2О + окрашенный продукт.

       Концентрация  образующегося  в  ходе  реакции  окрашенного   продукта
пропорциональна концентрации холестерина в пробе.
       Ход определения: Рабочий реагент обязательно вносить в пробирки после
проб, содержащих холестерин. Пробирки встряхнуть  и  инкубировать  при  t  =
37oС. Через 10 минут после начала инкубации пробирки повторно  встряхнуть  и
инкубировать 20 минут при t = 37oС.  Окрашенные  пробы  фотометрировать  при
500 нм в кювете с длиной оптического  пути  5  мм  или  10  мм  относительно
холостой пробы.  Окраска  стабильна  в  течении  двух  часов  при  комнатной
температуре.
       Концентрацию холестерина в исследуемых пробах рассчитать по формуле:
       [pic] ммоль/л, где
ЕОП и ЕК – оптические плотности исследуемой пробы и пробы с калибратором.
       Норма: 3,62 – 5,2 ммоль/л.

            2.2.4. Определение циркулирующих иммунных комплексов
               в крови методом ПЭГ-теста (Гриневич Ю.А., 1988)

       Метод основан на селективной преципитации комплексов АТ-АГ в  3,75  %
ПЭГ (полиэтиленгликоля) с последующим определением плотности преципитата.
       Реактивы:
       1) 0,1 м боратный  буфер  (3,410  г  борной  кислоты,  4,275  г  буры
          растворить в 1 л дистиллированной воды)
       2) 10 г полиэтиленгликоль – 6000 ед. растворить в 240 мл буфера.
       Ход определения: К 0,3 мл сыворотки крови добавить  0,6  мл  реактива
№1, перемешать и перенести по 0,3 мл в 2  пробирки.  В  I  добавить  2,7  мл
раствора  №1  (контроль).  Во  II  добавить  2,7  мл  раствора  №2   (опыт).
Перемешать, инкубировать в течение 60 минут при  комнатной  температуре.  На
спектрофотометре (КФК-3) определяют оптическую  плотность  в  кюветах  [pic]
при 450 нм.
       Расчет:  Высчитывают  разность  показателей   оптической   плотности,
результат умножают на 1000 и получают количество  ИК  в  100  мл  сыворотки.
Ответ выражают в единицах оптической плотности. [pic]  -  количество  ЦИК  в
100 мл сыворотки.
       Норма: 54,24 + 2,03 усл. ед.
       Пример расчета: больной Максимов С.И., 19 лет.
       [pic]
       [pic]
       Количество ЦИК в 100 мл сыворотки:
       [pic] усл. ед.

        2.2.5. Определение уровня МСМ в крови (Габриэлен Н.И., 1984)

       Метод основан на  осаждении  белков  из  исследуемой  жидкости  10  %
раствором ТХУ с  последующем  центрифугированием  и  определением  абсорбции
света супернатантом в 10 раз разведенным дистиллированной водой.
       Ход работы: Сыворотку  крови  обрабатывают  10  %  раствором  ТХУ.  В
качестве контроля лучше использовать сам раствор ТХУ в  30  раз  разведенный
дистиллированной водой. Оптическая  плотность  его  против  воды  составляет
0,123(0,012 усл. ед. на волне 254 нм при  23-25[pic]С.  Центрифигируем  3000
об/мин  в  течение  30  минут.  К  0,5  мл  надосадочной  жидкости  +4,5  мл
дистиллированной воды. Измерение проводим на  спектрофотометре  в  УФ  свете
при 280 нм для определения ароматических аминокислот и при длине  волны  254
нм  для  определения  нуклеотидов.  Уровень   МСМ   выражают   в   единицах,
количественно равных показателям экстинции.

          2.2.6. Определение показателей «эффективная концентрация
   альбумина» и «общая концентрация альбумина» в сыворотке крови человека
                           флуоресцентным методом
                            (Миллер Ю.И., 1994).

Принцип метода:
       Метод  основан   на   специфическом   взаимодействии   флуоресцентных
органических соединений с альбумином в сыворотке  крови.  В  зависимости  от
условий  этого  взаимодействия  интенсивность  флуоресценции  красителя   из
альбумина отражает различные свойства белка. Индекс ЭКА/ОКА  не  зависит  от
числа молекул альбумина в пробе и характеризует  физико-химические  свойства
молекулы альбумина.
       Состав набора:
       Реактив I (4 ампулы по 5 мл). Предназначен для приготовления раствора
используемого при разбавлении сыворотки  крови.  Он  содержит  антикоагулянт
ЭДТА.
       Реактив II (4  ампулы  по  0,7  мл).  Основным  компонентом  является
специальное   флуоресцирующее   соединение,   интенсивность    флуоресценции
которого  в  сыворотке  крови  пропорциональна  концентрации   сывороточного
альбумина.
       Реактив III (4 ампулы по 0,7 мл). Взаимодействие реактивов №2 и №3  с
сывороткой позволяет определить ОКА.
       Определение показателя ЭКА:
       К  2,0  мл  надосадочной  жидкости  добавить  0,025  мл  реактива  2.
Перемешать.   Измерить   интенсивность   флуоресценции   при   длине   волны
возбуждения 420 нм и длине волны испускания 515 нм.
       Определение показателя ОКА:
       В ту же пробу добавить 0,025  мл  реактива  3.  Перемешать.  Измерить
интенсивность флуоресценции. Нормальные  величины  показателя  ЭКА  лежат  в
интервале нормальных значений ОКА от 40 г/л – 55 г/л.
       Подготовка образцов крови к измерениям:
       Буферный раствор: Содержимое ампулы с реактивом 1 перенести в 100  мл
дистиллированной воды. Перемешать.  0,025  мл  сыворотки  крови  добавить  в
пробирку, содержащую 5 мл раствора для разбавления крови. Для анализа  берут
жидкость 2,0 мл полученного образца.
       Используют специализированный анализатор АКЛ-0,1.



     3. Результаты исследования и их обсуждение

           1. Определение показателей уровня интоксикации
      в сыворотке крови практически здоровых людей

       Нами было произведено исследование биохимических показателей  –  МДА,