Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК
СОКРАЩЕНИЙ..................................................................
............................3
ВВЕДЕНИЕ....................................................................
.........................................................4
ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................
....................................5
СТРОЕНИЕ
ИММУНОГЛОБУЛИНОВ............................................................
.......................5
ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ
ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У
МЛЕКОПИТАЮЩИХ...............................................................
.....7
ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ
ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ
ПОЗВОНОЧНЫХ......................................................11
ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ
ИГ..........................................................................
.............19
МАТЕРИАЛЫ И
МЕТОДЫ......................................................................
.....................24
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
ДНК.........................................................................
...................................24
ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ
ГЕЛЯ........................................................................
.........................24
ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ
ЗОНДОВ......................................................................
25
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ
ДНК.........................................................................
.............26
ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ
CsCl........................................26
ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ
КЛЕТОК...................................................27
ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ
РЫБ.................................................................28
ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ
ЛЕЙКОЦИТОВ.....................................................28
ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК
ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ
КЛЕТОК......................................................................
...............28
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ
кДНК......................................................................29
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ
РЕАКЦИЯ.....................................................................
..........33
СУБКЛОНИРОВАНИЕ
ДНК.........................................................................
..........................34
СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ
кДНК........................................................................
................34
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ДНК.............................35
САУЗЕРН БЛОТ
ГИБРИДИЗАЦИЯ................................................................
.....................36
РЕЗУЛЬТАТЫ..................................................................
...................................................38
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ
СКРИНИНГ.....................................38
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ
СТРУКТУРЫ...................................................................
...40
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ
СТРУКТУРЫ..............................................40
АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ
ОРГАНИЗАЦИИ.................................................................
.............41
ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................
..................................................46
ВЫВОДЫ......................................................................
.........................................................48
СПИСОК
ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................
..............................49
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИГ
иммуноглобулины
пн
пар нуклеотидов
тпн тысяч
пар нуклеотидов
е.а.
единица активности
ИПТГ
изопропилтиогалактозид
ТЕМЕД N,N,N,'N'-тетраметил-этилен-
диамин
трис
трис(гидроксиметил)аминометан
дНTФ
дезоксиаденозинтрифосфат
ддНТФ
дидезоксинеклеотидтрифосфат
дНТФ
дезоксинуклеотидтрифосфат
рATФ
рибоаденозинтрифосфат
ДТТ
дитиотрейтол
Na2ЭДТА этилендиаминтетраацетат
натрия
SDS
додецилсульфат натрия
X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бета-D-
галактозид
ВВЕДЕНИЕ
В основе функционирования гуморального иммунитета у млекопитающих
лежит сложный комплекс молекулярно-генетических и физиологических
механизмов, обеспечивающих реорганизацию, мутагенез и клональную экспрессию
генов иммуноглобулинов. Возникновение этой подсистемы иммунитета связывают
с появлением хрящевых рыб.
На ранних этапах эволюции гены ИГ были организованы в виде
повторяющихся кластеров V-J-C генных сегментов. При подобной организации
разнообразие продуцируемых антител основывалось, прежде всего, на
количестве имевшихся в геноме кластеров, каждый из которых кодировал один
вариант полипептидных субъединиц ИГ. В ходе дальнейшей эволюции произошел
переход от кластерной к сегментарной организации, обеспечивающей
дополнительный источник разнообразия за счет комбинативной рекомбинации
генных сегментов. Предполагается, что этот переход также имел важное
значение для регуляции экспрессии генов и осуществления механизмов
клонального отбора антителопродуцирующих клеток в ходе иммунного ответа.
Настоящая работа представляет собой часть проекта, направленного на
изучение эволюции механизмов изотипического исключения генов легких цепей
ИГ у низших позвоночных. Целями работы являлись изучение структуры и
организации генов легких цепей ИГ стерляди (Acipenser ruthenus),
представителя филогенетически древней группы костно-хрящевых рыб.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРОЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
Иммуноглобулины выполняют в организме позвоночных функцию гуморальных
антител и антиген-связывающих рецепторов В-лимфоцитов. Особенностью этого
класса белков является огромное разнообразие, позволяющее им вступать во
взаимодействие с фактически любыми биологическими макромолекулами.
Типичная молекула ИГ состоит из двух идентичных тяжелых (H) и двух
идентичных легких (L) полипептидных цепей. H- и L-цепи построены из
нескольких доменов, каждый из которых состоит примерно из 110
аминокислотных остатков. У млекопитающих существует пять классов H-цепей:
(, m, (, (, и (. Каждая H-цепь построена из одного N-концевого и нескольких
(трех или четырех) C-концевых доменов. N-концевые домены различаются в
разных молекулах и называются вариабельными (V) доменами. C-концевые домены
имеют одинаковую структуру у молекул одного класса и называются
константными (С) доменами (рис. 1) (Пол, 1987).
Среди L-цепей млекопитающих различают два типа: лямбда и каппа.
Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного и одного константного
доменов. В индивидуальной молекуле ИГ присутствует только один тип L-цепи
(Roitt et al., 1993).
Гигантское разнообразие ИГ обеспечивается прежде всего тем, что V и C
области кодируются разными генами (генными сегментами), физически
разнесенными в зародышевой ДНК.
В формировании вариабельных доменов H-цепей участвуют три генных сегмента:
вариабельный (V), D-сегмент (от англ. diversity- разнообразие) и J-сегмент
(от англ. joining- соединяющий). С-области Н-цепей разных классов
кодируются отдельными генами (Roitt et al., 1993).
Рис. 1. Схема строения молекулы иммуноглобулина.
Типичная молекула иммуноглобулина содержит две идентичные легкие (L)
и две идентичные тяжелые (H) цепи, связанные между собой ковалентно
дисульфидными связями. Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного (VL) и
одного константного (СL) домена. Н-цепь состоит из одного VH и нескольких
CН доменов.
В формировании зрелого гена L-цепи участвуют три генных сегмента: V-
сегмент и J-сегмент кодируют V-домен, C-сегмент кодирует константный домен.
На поздних стадиях развития В-лимфоцита генные сегменты, кодирующие
вариабельные домены, объединяются в различных сочетаниях, образуя матрицу
для экспрессии L- и H-цепей (Seidman et al., 1979; Durdik et al., 1984).
ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Различные виды млекопитающих имеют сходную схему организации и
экспрессии генов ИГ. Одним из наиболее изученных в этом отношении видов
является человек. Лямбда и каппа цепи ИГ у человека кодируются генами,
расположеными в разных локусах и на разных хромосомах. Каппа локус состоит
из большого количества V( генных сегментов, собраных в группы, пяти J( и
одного С( сегмента.. Такой тип организации называется сегментарным (рис.
2). Лямбда локус состоит из группы V( сегментов, точное количество которых
неизвестно, и семи пар J(-C( сегментов. Три из них (JC(4 - JC(6) являются
псевдогенами (Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993).
В процессе развития В-лимфоцита в кроветворных органах один из V
сегментов соединяется с одним из J сегментов посредством сайтспецифической
рекомбинации (Schatz et al., 1992). В этот процесс вовлекаются специальные
олигомерные последовательности: гепта- и нонамеры, фланкирующие с 3'
стороны V сегмент и с 5' стороны J сегмент (рис. 3) (Aguilera et al., 1987;
Hesse et al., 1989). Отличительной особенностью лямбда и каппа локусов
является конфигурация промежутков между гепта- и нонамерами, называемых
спейсерами. С V и J генными сегментами лямбда типа ассоциированы 23 пн и 12
пн спейсеры соответственно, а с V и J сегментами каппа типа - 12 пн и 23 пн
спейсеры (Durdik et al., 1984; Stavnezer et al., 1985).
л
Рис. 2. Схема строения лямбда и каппа локусов генов L-цепей ИГ
человека.
Лямбда локус содержит много V( сегментов и семь пар
близкорасположенных J(-C(. Три из них яляюся псевдогенами ((). Каппа локус
содержит много V( пять J( и один C( генный сегмент (Hieter et al., 1981;
Roitt et al., 1993).
Обозначения: - сигнальные олигомеры.
Рис. 3. Схема расположения олигонуклеотидных последовательностей,
задействованных в сайтспецифической рекомбинации в каппа локусе
млекопитающих. Эти последовательности фланкируют с 3‘ стороны VL сегмент и
с 5’ стороны JL сегмент. Во время рекомбинации гептамер и нонамер одного из
VL сегмента объединяются с гептамером и нонамером одного из JL сегмента.
Это делает возможным соединение VL и JL сегментов без нарушения рамки
трансляции (Aguilera et al., 1987; Hesse et al., 1989).
Обозначения: - сигнальные олигомеры.
Последовательность, в которой рекомбинируют локусы L-цепей, строго
упорядочена во времени. Показано, что первыми перестраиваются локусы каппа
типа, причем если в одной хромосоме перестройка оказалась нефункциональной,
тоесть не привела к появлению полноценного гена, то рекомбинация происходит
в каппа локусе на гомологичной хромосоме. В случае повторной абортивной
перестройки аналогично происходят перестройки в лямбда локусах. Если в
клетке непродуктивно перестроились все четыре локуса, то она превращатся в
0-клетку и подвергается апоптозу. Если же перестройка одного из локусов
привела к образованию функционального гена, то рекомбинация остальных
локусов блокируется. Детали механизма блокирования неизвестны, однако
установлено, что необходимым условием для него является транскрипция
продуктивно перестроенного гена. В результате в каждом индивидуальном
лимфоците синтезируется только один тип L-цепей, каппа или лямбда, и
экспрессия гена происходит только на одной из двух гомологичных хромосом.
Эти феномены, называемые изотипическим и аллельным исключениями лежат в
основе ключевого принципа функционирования иммунной системы - принципа
клональной селекции (Пол, 1987; Strob, 1987).
В организме млекопитающих генерируется свыше десяти миллионов
вариантов антител, хотя в геноме содержится значительно меньшее количество
генных сегментов, которые могут участвовать в формировании вариабельных
доменов. В случае L-цепей, основным источником разнообразия является
комбинативное сочетание V и J сегментов. Дополнительным источником является
смещение рекомбинационной рамки в месте их соединения. Кроме того, V генные
сегменты могут обмениваться участками ДНК с псевдогенами посредством генной
конверсии. Очень существенный вклад в разнообразие специфичностей антител
вносит соматическое мутирование вариабельных генных сегментов в сайтах,
участвующих в формировании антигенсвязывающего центра. Соматическое
разнообразие генерируется при вторичном иммунном ответе путем включения
гипермутационного механизма в клетках памяти в зародышевых центрах
лимфатических узлов (Tonegawa 1983; Roitt et al., 1993).
ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ
ПОЗВОНОЧНЫХ
Хрящевые рыбы.
Гуморальный иммунный ответ в виде специфических антител
обнаруживается только у позвоночных. Наиболее примитивными видами, у
которых обнаружена способность синтезировать ИГ, являются хрящевые рыбы.
Представители трех основных таксонов (акулы, скаты и химеры) продуцируют
антитела в ответ на введение широкого спектра антигенов. Однако, в отличие
от млекопитающих, гетерогенность сывороточных антител у хрящевых рыб
выражена очень слабо. Кроме того, у них не обнаружено созревание иммунного
ответа - при вторичном введении антигена спектр антител не меняется
(Flajnik, 1996). Результаты исследований последних лет продемонстрировали,
что организация генов ИГ у хрящевых рыб также имеет ярко выраженные
особенности.
У хрящевых рыб обнаружены гены трех типов L-цепей, локализующиеся в
разных локусах. В каждом локусе геные сегменты организованы в кластеры,
имеющие по одному V, J и C генному сегменту (рис. 4). Таких кластеров
содержится несколько десятков или даже сотен в одном локусе на расстоянии
12-15 тпн друг от друга (Rast et al., 1994).
Гены первого типа найдены у разнозубой акулы (Heterodontus francisci)
(Shamblott and Litman, 1989) и малого ската (Raja erinacea) (Anderson et
al., 1995). У акулы кластеры имеют размер 3-6 тпн. V и J, J и C генные
сегменты разделены примерно 0,5 и 4 тпн соответственно. У ската V и J
сегменты слиты в зародышевой ДНК.
Гены второго типа обнаружены у пятнистой химеры (Hydrolagus colliei)
(Maisey, 1984), песчаной акулы (Carcharhinus plumbeus) (Hohman et al.,
1992; Hohman et al., 1993), разнозубой акулы и малого ската (У всех
изученных видов в кластерах этого типа V и J генные сегменты соединены уже
в зародышевом геноме. V и C гeнные сегменты разделены 2-3 тпн.
Рис. 4. Схема строения локусов генов L-цепей ИГ у акулы.
Организация генов у акулы имеет кластерный тип. Каждый кластер имеет
размер 3 - 6 тпн и содержит по одному VL, JL и CL генному сегменту.
Обнаружено три типа генов L-цепей ИГ. Локусы генов первого и третьего
типов имеют схожую организацию. В этом случае VL и JL, JL и CL сегменты
разделены примерно 0,5 и 4 тпн соответственно (А) (Rast et al., 1994).
В локусе генов второго типа VL и JL сегменты соединены уже в
зародышевом геноме (Б).
Третий тип генов L-цепей найден у акулы-няньки (Gynglimostoma
cirratum) (Greenberg et al., 1993) и разнозубой акулы (Rast et al., 1994).
В кластерах этого типа V и J, J и C генные сегменты разделены, как и в
кластерах первого типа, примерно 0,5 и 4 тпн соответственно. V и J генные
сегменты фланкируются сайтами специфической рекомбинации со спейсерами 12 и
23 пн, что соответствует конфигурации спейсеров в локусах каппа типа
млекопитающих. По первичной структуре гены третьего типа тоже наиболее
близки к генам каппа типа высших позвоночных (гомология по аминокислотной
последовательности составляет около 60%).
Гены этих трех типов имеют между собой низкую степень гомологии:40-
50% по нуклеотидной последовательности С сегментов и 50-60% по
последовательности V сегментов (Hohman et al., 1993).
Полученные данные показывают, что у хрящевых рыб имеется очень
большое количество генных сегментов. Однако специфика организации генов
исключает комбинативное сочетание сегментов. Все разнообразие антител у
хрящевых рыб формируется только за счет экспрессии большого количества
кластеров.
Данные о нуклеотидных последовательностях из разных локусов выявили
низкую гетерогенность генов (85-95%), что указывает на отсутствие
соматического мутагенеза (Rast et al., 1994).
Костистые рыбы.
Анализ сывороточных антител пещерного сомика (Ictalurus punctatus)
показал наличие трех типов L-цепей с различными молекулярными массами: 26,
24 и 22 кДа. Два вида антител мыши, 3F12 и 1G7, захватывают более 90% от
общего количества иммуноглобулинов в реакции иммунопреципитации. При этом
3F12 антитела связываются с молекулами, содержащими L-цепи массой 24 и 22
кДа, а 1G3 антитела с другой субпопуляцией, содержащей L-цепи массой 26
кДа. На основе этих данных L-цепи разделяют на два класса, называемые F и G
(Lobb et al.,1984).
Геномная организация локуса L-цепей G типа имеет кластерный тип (рис.
5). В каждом кластере содержится по одному J и C сегменту и два V сегмена.
Вариабельные генные сегменты расположены всегда в противоположной
транскрипционной полярности к J и C сегментам . В ряде геномных клонов один
V сегмент располагался с 3' стороны от C генного сегмента. Размер кластера
равен примерно 3 тпн, расстояние между кластерами около 6 тпн (Ghaffari and
Lobb, 1993; Bengten, 1994).
Хотя гены L-цепей сомика имеют низкую гомологию с генами других
позвоночных (40-50% по нуклеотидной последовательности), их можно отнести к
каппа типу высших позвоночных, так как сходство по первичной структуре с
лямбда типом ниже. Кроме того, конфигурация спейсеров имеет характер каппа
типа: 12 пн спейсер ассоциирован с V, 23 пн спейсер с J сегментом (Ghaffari
and Lobb, 1993).
У радужной форели (Oncorhynchus mykiss), представителя другого
семейства костистых рыб, также обнаружены два типа L цепей (Daggfeldt et
al., 1993). Один из них (L1) высокогомологичен G типу сомика по структуре V
и C областей и соответствующий локус имеет сходную организацию.
По-видимому, у этих видов объединение V и J сегментов происходит
только за счет инверсий с восстановлением единой полярности транскрипции.
Разнообразие вариабельных доменов образуется в результате комбинативного
сочетания V и J сегментов в пределах одного кластера. Не исключается, что в
перестройки могут вовлекаться и соседние кластеры.
Интересной особенностью костистых рыб является очень высокая
пропорция мРНК, представляющей так называемые стерильные транскрипты
(Ghaffari and Lobb, 1993). Эти транскрипты включают в себя только С-
сегменты и фланкирующие их 5’и 3’-нетранслируемые участки. Количество
стерильных транскриптов у сомика и форели в 5 раз превышает количество
полных VJC-транскриптов.
Рис. 5. Геномная организация локуса генов L-цепей ИГ у пещерного
сомика.
Генные сегменты организованы в кластеры. Каждый кластер содержит два
VL и по одному JL и CL сегменту и имеет размер около 5 тпн. Расстояние
между JL и CL около 1000 пн, VL сегменты удалены от 5' конца JL сегмента на
3 тпн. VL сегменты всегда расположены в противоположной транскрипционной
полярности по отношению JL и CL сегментам (Ghaffari and Lobb, 1993).
Амфибии.
У шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) выявлено три семейства генов L-
цепей ИГ, кодирующих три различных изотипа: L1 (ро), L2 (сигма) и L3 (рис.
6).
Все три локуса имеют сегментарный характер организации. L1 локус
содержит множественные VL1 сегменты, разделенные в геноме 2.1 - 3.6 тпн,
пять JL1 сегментов, три из которых идентичны, и один CL1 генный сегмент
(Stewart et al., 1993). JL1 и VL1 сегменты фланкируются каноническими гепта-
и нонамерными сигнальными последовательностями, разделенными 12 пн у VL1 и
23 пн у JL1 сегментов (Sakano et al., 1980).
Локус генов второго типа разделяется на два семейства, (1 и (2,
которые в геноме располагаются отдельно. Геном лягушки содержит
множественные V(1 и несколько V(2 геных сегментов, одну пару J(1-C(1 и пару
J(2-C(2 (Schwager et al., 1991). Расположение генов этого типа друг
относительно друга точно не определено.
Недавно был обнаружен третий тип генов L-цепей у лягушки. В геноме
лягушки содержится шесть семейств V сегментов этого типа. Общее количество
VL3 элементов составляет по меньшей мере 30 копий. Каждый VL3 элемент может
рекомбинировать с одной из двух пар JCL3 генных сегментов (Haire et al.,
1996).
Гены трех типов значительно различаются: гомология на аминокислотном
уровне составляет приблизительно 30% (Zezza et al., 1991). В то же время,
ряд признаков позволяет соотнести гены L1 и L3 типа с каппа и лямбда типами
млекопитающих.
Семейство генов первого типа можно отнести к каппа типу по нескольким
причинам (Zezza et al., 1992): а) высокая гомология первичной структуры
(более 50%); б) существенное сходство геномной организации локуса (много
VL1 и один CL1 генный сегмент); в) кофигурация спейсеров между гепта- и
нонамерыми соответствует каппа типу; г) JL1 и CL1 генные сегменты разделены
примерно 3.5 тпн, что приблизительно равно расстоянию между JL( и CL(
элементами человека (Sakano et al., 1979; Hieter et al., 1982) и
значительно больше чем расстояние между JL( и CL( млекопитающих (Blomberg
et al., 1982; Udey, 1987).
Рис. 6. Геномная организация локуса первого и третьего типов генов L-
цепей ИГ у шпорцевой лягушки.
Локус семейства L1 содержит множественные VL1 сегменты, пять JL1
сегментов один CL1 генный сегмент. Расстояние между VL1 равно 2.1 - 3.6
тпн. Локус семейства L3 имеет около 30 VL3 сегментов, располагающихся
группами, JL3 и CL3 сегменты располагаются парами: JCL31 и JCL32 (Stewart
et al., 1993; Haire et al., 1996).
Третий тип генов L-цепей лягушки более близок к лямбда типу
млекопитающих: а) более высокая гомология с генами лямбда типа
млекопитающих (около 50% с (- и 30-40% с (-типом по аминокислотной
последовательности); б) JL3 и CL3 генные сементы экспрессируются всегда
парами JL31-CL31 и JL32-CL32, что напоминает ситуацию в лямбда локусе
человека и мыши (Haire et al., 1996).
Гены второго типа L-цепей лягушки незначительное и приблизительно
одинаковое сходство с генами каппа и лямбда типов млекопитающих (30-40% и
25-40% по нуклеотидной последовательности, соответствено) (Schwager et al.,
1991).
Генетическое разнообразие у лягушки достаточно велико и сравнимо с
разнообразием генов у млекопитающих. Однако репертуар антительных
специфичностей в сыворотке крови значительно уступает репертуару высших
позвоночных (Hsu et al., 1991). Этот парадокс можно объяснить наличием
механизма соматической селекции клонов В-лимфоцитов, который элиминирует
клетки, несущие антитела, специфичные к собственным антигенам организма, а
также те клетки, которые продуцируют несколько типов антител (Wilson et
al., 1992).
Основной вклад в формирование разнообразия L-цепей антител у лягушки
дают первое и третье семейства генов, имеющие высокий комбинативный
потенциал и большое разнообразие зародышевых V генных (Haire et al., 1996).
Второе семейство имеет несколько слабо отличающихся друг от друга VL2
элементов и не играет существенной роли в формировании разнообразия
(Stewart et al., 1993). Таким образом, разнообразие генов L-цепей у лягушки
а создается посредством: а) комбинативного соединения V и J генных
сегментов; б) смещения рекомбинационной рамки при соединении V и J
сегментов. Нельзя исключить, что определенный вклад в разнообразие может
вносить соматический мутагенез. Во всяком случае, наличие этого механизма
показано для генов H-цепей лягушки (Zezza et al., 1992).
ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ
Согласно наиболее популярной в настоящий момент гипотезе гены ИГ и Т-
клеточных рецепторов произошли от одного предкового гена, кодировавшего
один домен путем различных вариантов последовательных дупликаций (рис. 7).
В эволюции генов ИГ можно выделить три основных события.
1. Разделение предкового V-подобного гена на V и J сегменты и
возникновение механизма генерации разнообразия путем соматической
рекомбинации. Предпологается, что это событие связано с внедрением
транспозона в предковый ген и осуществилось до разделения ИГ и Т-клеточных
рецепторов у предков хрящевых рыб (Gilbert, 1990). Наличие в геноме акул и
скатов слитых VJ генов в локусах L-цепей классов I и II, является, по-
видимому, вторичным событием и, возможно, обусловлено фиксацией генов,
кодирующих антитела строго определенной специфичности (Anderson et al.,
1995).
2. Возникновение механизмов соматического мутагенеза генов ИГ. У
млекопитающих соматический мутагенез обеспечивает как минимум половину
разнообразия антител, являясь основой аффинного созревания антител при
вторичном иммунном ответе (Пол, 1987). Достаточно выражен соматический
мутагенез также у птиц (Thompson and Neiman, 1987; Reynaund et al., 1987).
Ряд данных позволяет предполагать, что соматический мутагенез может
осуществляться у хрящевых рыб и у амфибий, но эти результаты нуждаются в
более тщательном изучении. В частности, у хрящевых рыб получение
достоверных свидетельств затруднено наличием множественых кластеров генов,
что не позволяет надежно соотносить данные по геномной структуре и
структуре кДНК (Litman et al., 1993).
3. Переход от кластерной к сегментарной организации генных сегментов.
Сегментарная организация может иметь несколько преимуществ. Во-первых,
увеличивается разнообразие продуцируемых антител за счет дополнительных
возможностей комбинирования разных V и J сегментов. Во-вторых, уменьшается
размер локуса за счет
Рис. 7. Гипотетическая схема эволюции структурной организации локусов
генов L-цепей ИГ позвоночных. (Anderson et al., 1995; Gilbert, 1990).
Обозначения: - сигнальные олигомеры, фланкирующие V и J сегменты.
резкого сокращения количества C генов. В-третьих, подобная организация
позволяет упростить регуляцию экспрессии различных локусов.
Ключевым принципом функционирования иммунной системы является принцип
клональной селекции иммунокомпетентных клеток, несущих рецептор
определенной специфичности. Ряд косвенных данных позволяет считать, что у
акул гуморальный иммунный ответ клонально ограничен (Shankey and Clem,
1980). Однако неизвестно, каким образом и насколько эффективно
осуществляется это ограничение (Flajnik, 1996). У млекопитающих принцип
“одна клетка - одно антитело” обеспечивается благодаря изотипическому и
аллельному исключению. При сегментарной организации генов продуктивная
перестройка в одном из локусов ведет к блокированию перестройки других
локусов и, тем самым к их инактивации. Однако, в случае наличия
множественных VJC кластеров, в части из которых VJ сегменты слиты в
зародышевой ДНК, механизмы контроля выборочной экспрессии могут быть более
сложными или не столь эффективными. Таким образом, переход от кластерной к
сегментарной форме организации генов ИГ мог иметь принципиальное значение
для формирования полноценной системы гуморального иммунитета.
Вопрос о том, на каком этапе филогенеза произошел этот переход
остается открытым. Уже у амфибий гены ИГ L- и Н-цепей организованы
сегментарно. При этом, в случае L-цепей наблюдается два основных типа
организации: каппа-подобный (один С ген, семейство J сегментов и семейство
V сегментов) и лямбда подобный (несколько пар JC и семейство V сегментов).
По всей видимости, различные типы L-цепей амфибий произошли от различных
типов L-цепей хрящевых рыб, однако относительно невысокая гомология по
первичной структуре не позволяет утверждать этого с определенностью
(Gilbert, 1990).
У сомика и радужной форели, представителей костистых рыб, организация
генов L-цепей и Н-цепей отличается. Гены Н-цепей костистых рыб организованы
подобно млекопитающим сегментарно (Bengten et al., 1991). Организация генов
L-цепей имеет кластерный характер. В то же время, в отличие от хрящевых
рыб, транскрипционная ориентация V генов у них изменена.
Следует отметить, что сомовые и лососевые являются довольно
специализированной группой, возникшей в эволюции относительно недавно (Рис.
8). Особенности организации генов легких цепей у этих таксонов могут
представлять собой новоприобретенные признаки (Romer, 1966).
В связи с этим особый интерес представляет изучение структры и
организации генов L-цепей ИГ у костно-хрящевых рыб. Костно-хрящевые
являются архаичной группой костистых рыб, возникшей значительно раньше
настоящих костистых. Несмотря на то, что существуют различные мнения
относительно последовательности появления костно-хрящевых и двоякодышащих
(предков наземных позвоночных) (Ромер и Парсонс, 1992; Юдкин И. И., 1941),
очевидно, что костно-хрящевые в большей степени чем коститстые сохранили
черты древних первично-костных рыб и, соответственно, с большим основанием
могут рассматриваться как промежуточное звено между хрящевыми рыбами и
амфибиями.
Рис. 8. Эволюционное древо низших позвоночных ( по Северцеву А. Н.,
1939).
Обозначения: - таксоны, имеющие ныне живущих представителей, -
таксоны, существование которых доказано палеонтологическими исследованиями.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК
В агарозном геле.
Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в 1-кратном буфере
ТАЕ, имеющем состав: 0.04 М трис-ацетат, 2 мМ Na2ЭДТА (Маниатис и др.,
1984).
В полиакриламидном геле.
Электрофорез ДНК проводили в 6% полиакриламидном геле в 0,5-кратном
буфере ТБЕ, имеющем состав: 0,089 М трис-борат, 0,089 М борная кислота, 2
мМ Na2ЭДТА. Для полимеризации геля к 50 мл раствора добавляли 300 мкл 10%
раствора персульфата аммония и 30 мкл ТЕМЕД (Маниатис и др., 1984).
ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ГЕЛЯ
Адсорбция на диэтиламиноэтилцеллюлозе.
Гель окрашивали в растворе бромистого этидия, участок геля с полосой
ДНК вырезали, помещали в камеру и переносили ДНК на
диэтиламиноэтилцеллюлозу в 0,5-кратном буфере ТБЕ (см. Электрофорез ДНК
(2)) при напряжении 40 В/см. Элюцию ДНК с диэтиламиноэтилцеллюлозы
проводили путем инкубирования в течение 30 мин при 70оС в буфере, имеющем
состав: 2 мМ NaCl, 1 мМ Na2ЭДТА, 40 мМ трис рН 8,0 (Маниатис и др., 1984).
Адсорбция на кремниевой пудре.
Агарозный гель окрашивали в растворе бромистого зтидия, вырезали
участок геля с ДНК и расплавляли инкубированием с двойным объемом 6 М
раствора KI в течение 10 мин при 55оС. Затем добавляли суспензию кремниевой
пудры (силики) в 3 М растворе KI в концентрации 100 мг/мл из расчета 300
мкг силики на 1 мкг ДНК и инкубировали в течение 2 мин при 55оС. После
этого осаждали силику центрифугированием при 2000 g в течение 2 мин и
дважды промывали суспендированием в растворе, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ
трис-HCl, рН 8,0, 2,5 мМ Na2ЭДТА и 50% этиловый спирт. Элюировали ДНК с
силики суспендированием в воде (Boyle, Lew, 1995).
Замораживание - оттаивание.
Агарозный гель с ДНК 10 мин инкубировали в жидком азоте и осаждали
центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин, после чего добавляли к
супернатанту 1/10 объема 3 М NaAc, 2 объема этанола и осаждали ДНК при
12000 g в течение 10 мин.
ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ЗОНДОВ
500 нг ДНК-матрицы и 100 нг праймера денатурировали в 10 мкл воды при
100оС в течение 10 мин и быстро охлаждали до 0оС. Затем добавляли 10 мкл 10-
кратного буфера (40 мМ KP04 рН 7,5, 6,6 мМ MgCl2 и 1,0 мМ 2-
меркаптоэтанол), 0,1-0,5 мКи 32Р-dATФ, 10 мкл 2 мМ раствора трех других
немеченых дНTФ до концентрации 200 мкМ. Объем реакционной смеси доводили
водой до 100 мкл, добавляли 3 мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (10-12
е.а.) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Очистку
зонда проводили методом гель - фильтрации на колонке с биогелем П-10
(Маниатис и др., 1984).
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
Клетки Escherichia coli, выращенные в среде Луриа-Бертани (1% NaCl,
1% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, рН 7,5) (среда LB) с
ампициллином (50 мкг/мл), осаждали центрифугированием при 4000 g. Затем
осадок суспендировали в буфере STET (8% сахароза, 0,5% тритон X-100, 10 мМ
трис-HCl и 50 мМ Na2ЭДТА, рН 8,0) и добавляли лизоцим до концентрации 0,8
г/мл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и при
100оС в течение 1 мин. После этого клеточный дебрис осаждали
центрифугированием при 16000 g в течение 15 мин.
Для осаждения плазмидной ДНК к супернатанту добавляли 1/10 объема 3 М
раствора ацетата натрия, равный объем изопропанола и центрифугировали при
16000 g в течение 15 мин при 20оС. Затем промывали осадок добавлением 80%
этанола и повторным центрифугированием в течение 5 мин при 20оС (Маниатис и
др., 1984).
ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В
ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ CsCl
На каждые 10 мл раствора плазмидной ДНК, полученного после осаждения
лизированных клеток (см. Выделение плазмидной ДНК), добавляли 1 г сухого
CsCl, соль растворяли, после чего на каждые 10 мл раствора добавляли 0,8 мл
раствора бромистого этидия с концентрацией 10 мг/мл. Смесь помещали в
центрифужные пробирки Beckman, заполняли доверху раствором CsCl и
бромистого этидия той же плотности и центрифугировали в роторе Ti 60 при
45000 об/мин и температуре 20оС в течение 36 часов. После этого отбирали
кольцевую ковалентно замкнутую плазмидную ДНК и экстрагировали бромистый
этидий из раствора до полного обесцвечивания равным объемом н-бутанола,
предварительно насыщенного 1 М раствором NaCl.
ДНК осаждали центрифугированием при 15000 g, добавив равный объем 1 М
раствора NH4Cl и два объема этанола. После промывания этанолом осадок ДНК
растворяли в воде до концентрации 1 мкг/мкл (Маниатис и др., 1984).
ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Химическая трансформация.
Для подготовки компетентных клеток E.coli штамм XL-1 Blue MRF ' и
выращивали в 100 мл 2-кратной среды Луриа (2% бакто-триптон, 1% бакто-
дрожжевой экстракт, 0,1% NaCl, 0,4% глюкоза, рН 7,0) при 37оС до оптической
плотности D550=0,35. Клеточную суспензию выдерживали при 0оС в течение 2
часов. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000 g, температуре 4оС
и суспендировали в 50 мл ледяного буфера А (100 мМ CaCl2, 70 мМ MnCl2, 40
мМ NaAc, рН 5,5). После этого суспензию клеток выдерживали при 0оС в
течение 30 мин, после чего клетки осаждали и суспендировали в 5 мл буфера А
с 15% глицерина.
Для трансформации к 200 мкл суспензии компетентных клеток добавляли
30 нг плазмидной ДНК, растворенной в 100 мкл воды и выдерживали при 0оС в
течение 30 мин. Затем инкубировали при 37оС в течение 5 мин, после чего
добавляли 3 мл среды LB и инкубировали при 37оС еще 90 мин. Клетки собирали
центрифугированием и высевали на селективную среду (Мазин и др., 1988).