реферат Механизмы устойчивости опухолей к цисплатину

ЗМІСТ


            1.                     Транспорт                     цисплатина
                               2
            2.         Внутрішньоклітинна         мішень         цисплатина
                4
            3. Вплив цисплатина на клітинний цикл та індукція апоптозу    5
            4. Механізми резистентності пухлинних клітин до цисплатина  7
            4.1. Механізми клітинної резистентності на
            рівні                 цитоплазматичної                 мембрани
                        7
            4.2.   Внутрішньоклітинні    тіолові    детоксикуючі    системи
         9
            4.2.1.                    Система                    глутатіону
                                 9
            4.2.2.                                           Металотеонеіни
                                 10
            4.3.            Репарація            пошкоджень             ДНК
                       11
            4.4. Зміни генома, що асоційовані з резистентністю
                                     до                          цисплатина
                                     15

            Список                   використаних                    джерел
                        21



            Цисплатин є одним  з  найбільш  загальновживаних  препаратів  у
       лікуванні  солідних  пухлин  людини.  Однак  ефективне   застосування
       цисплатина у  клініці  часто  лімітується  токсичністю  препарату  та
       розвитком резистенстності до нього. Резистентність до цисплатина  має
       комплексний характер  і  пов`язана  з  рядом  особливостей  пухлинних
       клітин, включаючи  зміни  в  проникності  цитоплазматичної  мембрани,
       підвищення активності детоксикуючих та репаративних  систем  клітини,
       порушення експресії генів  fos,  nm23,  p53,  mdm2,  bcl-2  та  інші.
       Порушення біохімічних сигнальних шляхів апоптозу  також  можуть  бути
       основою для розвитку резистентності. Розуміння молекулярних основ дії
       цисплатина та механізмів розвитку резистентності до  нього  дозволять
       значно покращити результати клінічних випробувань препарату.



                     1.Транспорт цисплатина


             Взаємодія цисплатина з плазматичною мембраною є першою  щаблею
       багатостадійного процесу реалізації цитотоксичного ефекту  препарату.
       Ступінь пошкодження мембран цитостатиком залежить  від  текучості  їх
       ліпідної компоненти, яка визначається швидкістю проходження  процесів
       перекисного окислення ліпідів [1].
                 На сьогодні  існують  дві  гіпотези  поглинання  препарату
       пухлинною   клітиною.   Більш   аргументована   гіпотеза    пасивного
       транспорту,  основана  на  фактах  відсутності  інгібування  переносу
       цисплатина за допомогою  його  структурних  аналогів  та  проникнення
       цисплатина в  клітину  без  насичення  до  межі  його  розчинності  у
       культуральному середовищі [2]. Але ряд вчених відстоює ідею існування
       активного  транспортера  цисплатина.  У  1984  році   був   відкритий
       інгібітор   синтезу   протеінів   бензальдегід,   який    послаблював
       цитотоксичний ефект цисплатина за рахунок зменшення його  накопичення
       в клітині. Інший відомий інгібітор білкового синтезу –  циклогексамід
       не  мав  такого  ефекту.  Це  й  стало  основою  для  заключення,  що
       бензальдегід якимось чином безпосередньо реагує з мембранним  білком-
       транспортером, уповільнюючи  таким  чином  проникнення  цисплатина  у
       клітину [3].
                 Піздніше було знайдено, що альдегідні похідні  пиридоксаль
       та  пиридоксаль-5-фосфат  також   значно   послаблюють   цитотоксичну
       активність цисплатина. Відомо, що ці речовини утворюють основи  Шиффа
       з аміногрупами на поверхні клітини. Було показано, що і  бензальдегід
       і інші похідні інгібують проникнення цисплатина у клітину  на  50%  у
       порівнянні з контролем. Є дані про те, що попередня інкубація  клітин
       з  інгібітором  Nа/К  АТФ-ази  уабаіном  також  зменшує   проникнення
       цисплатина у клітину на 50%. Подальші дослідження  у  цьому  напрямку
       показали,  що  безпосередньо  Nа/К   АТФ-аза   не   є   транспортером
       цисплатина, однак транспорт ліків Na-залежний, а також  залежить  від
       мембранного потенціалу клітини [4,5].
                 Розглянемо загальновживану модель акумулювання  цисплатина
       в клітині, яка влаштовує прибічників обох гіпотез. Швидке накопичення
       половини цисплатина у клітині проходить за рахунок пасивної  дифузії,
       тоді як інша половина транспортується через канали, що  закриваються.
       Якщо активність останніх заблоковано, то  можна  очикувати  зменшення
       проникнення  цисплатина  в  клітину  на  50%.  Дані   про   регуляцію
       активності  каналів  дозволяють  зробити  висновок,  що   проходження
       цисплатина через них регулюється каскадом реакцій фосфорилювання,  що
       ініціюються  протеінкіназою  А  (РКА),  протеінкіназою  С  (РКС)   чи
       кальмодулінзалежними  кіназами  [3].  Здатність   мембранонепроникних
       альдегідних похідних блокувати накопичення цисплатина  у  клітині  на
       50%  обумовлюється  реактивністю  зовнішніх  аміногруп   білків,   що
       формують такий канал. Той факт,  що  інгібування  початкового  потоку
       цисплатина у  клітину  на  50%  відбувається  за  допомогою  уабаіна,
       підтверджує, що повний мембранний градієнт, зумовлений Na/K АТФ-азою,
       важливий для роботи каналів.
                 Bиведення цисплатина з клітини – двохфазний процес з  дуже
       короткою почaтковою фазою тривалістю 5 хв та  більш  довгою  кінцевою
       фазою  [6,7].   Встановлено   існування   АТФ-залежного   переносника
       цисплатина кон`югованого з  глутатіоном  [8,9].  Описана  АТФ-залежна
       глутатіон-S-кон`югат експортуюча помпа (ГS-Х-помпа) , що має  широкий
       спектр субстратної специфічності  та  транспортує  органічні  аніони,
       лейкотрієн С4 та інші сполуки, що несуть великі гідрофобні ділянки та
       хоча б два від`ємні заряди. ГS-Х-помпа виводить  потенційно  токсичні
       кон`югати глутатіон-S-платина (ГS-Pt) з пухлинних клітин, таким чином
       беручи участь в формуванні резистентності клітин до цисплатина [10].


            2.Внутрішньоклітинна мішень цисплатина.

            Внутрішньоклітинною мішенню цисплатина є ДНК, з  якою  препарат
       ковалентно зв`язується. Біфункціональні продукти взаємодії цисплатина
       з ДНК,  що  називаються  цисплатин-ДНК-адукти,  блокують  реплікацію,
       транскрипцію і, як наслідок, - клітинну проліферацію.  Цисплатин  діє
       на 7-му позицію залишка гуаніна та формує декілька  типів  адуктів  з
       основами ДНК. Два основні адукти це  G-G  внутрішньоланцюгові  зшивки
       (складають 60-65% усіх адуктів), A-G внутрішньоланцюгові зшивки ( 20-
       25% усіх адуктів), а також міжланцюгові та ДНК-білкові  зшивки  [11].
       Після дії цисплатина основна кількість адуктів утворюються вже  через
       6-12  годин  [12].  Формування  адуктів  відбувається  в  два  етапи.
       Спочатку має місце швидкий етап алкілування: один ланцюг  ДНК  формує
       цисплатин-моноадукт. Далі повільна фаза: реакція з`єднання  з  другим
       ланцюгом.
            Більшість робіт у напрямку дослідження взаємодії цисплатина  та
       ДНК стосується ядерної ДНК. Але в останні роки  вчених  зацікавила  у
       цьому відношенні мітохондріальна ДНК. Виявилось, що  ця  ДНК  у  4-50
       разів (для різних модельних систем) більш  чутлива  до  пошкоджуючого
       ефекту цисплатина, ніж ядерна ДНК [13,14]. А у  зв`язку  з  сучасними
       уявленнями про роль мітохондрій у реалізації  програми  апоптозу  цей
       факт набуває нового значення.


            3.Вплив цисплатина на клітинний цикл та індукція апоптозу.

            Відомо, що у багатьох модельних системах in vitro цисплатин  не
       э  фазоспецифічним  протипухлинним  препаратом.  Пухлинні  клітини  у
       різних фазах клітинного циклу однаково чутливі  до  нього  [15].  Але
       дані деяких досліджень свідчать про те,  що  все  таки  у  фазі  G2/M
       клітини  є  більш  чутливими  до   дії   цитостатика   [16].   Низькі
       концентрації цисплатина у клітинах викликають уповільнене проходження
       S-фази і зупинку у G2/M-фазі клітинного циклу [17]. В залежності  від
       концентрації препарату і, відповідно, пошкодження ДНК, клітина  після
       G2/M-зупинки вступає в наступну фазу клітинного циклу  –  мітоз,  або
       входить в апоптоз. Щодо  дії  цитостатика  на  регулятори  клітинного
       циклу, то встановлено, що цисплатин не впливає на внутрішньоклітинний
       вміст цикліну А  [18].  Але  при  дії  препарату  збільшуються  рівні
       цикліну В, p34cdc2 а також зростає активність гістон Н1-кінази  [19].
       Після дії цисплатина підвищується експресія цикліну D1, cdk4, а також
       збільшується  рівень  фосфорилювання  білка   ретинобластоми,   тобто
       з`являються усі ознаки руху  клітини  по  клітинному  циклу  [20].  І
       дійсно, якщо обробляти цисплатином клітини, що  знаходяться  у  стані
       спокою (G0), вони виходять у G1-фазу,  повільно  проходять  S-фазу  і
       зупиняються у G2/M-фазі клітинного циклу.
            Після  пошкодження  ДНК  цисплатином  у  клітинах  відбувається
       збільшення експресії білка Р53  і  Р53-залежне  підвищення  експресії
       білка р 21, який і спричиняє зупинку клітинного циклу [21].
            Субтокичні дози цисплатина індукують загибель клітин  за  типом
       апоптозу,  з  усіма  характерними  біохімічними   та   морфологічними
       ознаками  процесу:  екстерналізацією   фосфотидилсерину,   активацією
       каспаз, фрагментацією ДНК, утворенням апоптичних тілець [22-24].
            В багатьох модельних системах in vitro показано,  що  лікарські
       протипухлинні  препарати,  в  тому  числі  і  цисплатин,   викликають
       підвищення експресії поверхневого рецептора Fas, що потребує  синтезу
       білка de novo [25], а також його ліганда FasL [26]. Але  на  сьогодні
       вважається, що  індукований  проитипухлинними  ліками  апоптоз  не  є
       залежним від активації безпосередньо Fas-системи,  оскільки  вживання
       антагоністичних  анти-CD95  моноклональних  антитіл  не  впливало  на
       розвиток апоптозу під дією цитостатиків [27].
            Особливо цікавими є дані щодо ефекторних  механізмів  апоптозу,
       індукованого цисплатином. Відомо, що  у  цьому  процесі  бере  участь
       каспаза-3, оскільки застосування її інгібіторів білка CrmA та  Z-VAD-
       CH2DCB призводить до гальмування апоптозу, спричиненого  цитостатиком
       [28,29]. Каспаза-3 активує інші каспази, крім того  розщіпляє  фактор
       ініціації трансляції 4G (eIF4G), що призводить до гальмування синтезу
       білка [30].


            4.Механізми резистентності пухлинних клітин до цисплатина.
            4.1.Механізми     клітинної     резистентності     на     рівні
       цитоплазматичної мембрани

            Одним  з  основних  механізмів  клітинної   резистентності   до
       цисплатина розглядають особливості будови  цитоплазматичної  мембрани
       та прямого та зворотнього транспорту крізь неї.
            Однією з особливостей пухлинних  клітин,  резистентних  до  дії
       цисплатина, є  зменшена у порівнянні з чутливими клітинами акумуляція
       препарату [31,32].
                 Дана модель  пояснює,  чому  так  багато  клітинних  ліній
       резистентних до дії цисплатина відрізняються  зменшеним  накопиченням
       цисплатина. Мутації, що  призводять  до  змін  структури  каналів  чи
       гіперполяризації клітинної  мембрани,  можуть  спричинити  виникнення
       резистентного клона клітин.
                 Нещодавно до клітин мишиної лімфоми R1.1, резистентних  до
       дії цисплатина були одержані антитіла, які реагували з глікопротеідом
       з  молекулярною  масою  200кД,  гіперекспресованим  на  поверхні  цих
       клітин. Кількість білка на клітинній поверхні знаходилась у зворотній
       залежності від акумулювання цисплатина у  клітинах  та  корелювала  з
       рівнем їх чутливості до  цисплатина.  Було  запропоновано,  що  даний
       білок може бути аналогом Р-глікопротеіда  (Pgp)  і  є  непрацездатним
       каналом, що гіперекспресований на клітинній поверхні для  компенсації
       дефектної функції [33].
            В резистентних до  цисплатина  клітинах  з  підвищеним  вмістом
       глутатіона  часто  спостерігається   гіперекспресія   ГS-Х-помпи.   В
       цитоплазматичних везикулах таких клітин знаходиться більше кон`югатів
       ГS-Pt,  ніж  в  чутливих  клітинах  [34].   Така   внутрішньоклітинна
       компартменталізація  ліків  та   продуктів   їх   метаболизму   також
       вважається одним з механізмів лікарської резистентності.  В  багатьох
       випадках  резистентні  пухлинні  клітини   відрізняються   розвинутою
       везикулярною сіткою, що дозволяє їм просторово нейтралізувати токсини
       та виводити їх шляхом екзоцитозу.
            В експериментах з  використанням  бутионінсульфоксиміна  (BSO),
       інгібітора синтезу   глутатіона,  було  показано,  що  при  витощенні
       внутрішньоклітинного глутатіона  активність   ГS-Х-помпи  лише  трохи
       зменшується  [35].  Таким  чином,  ефективність   транспорту   ГS-Pt-
       кон`югатів  визначається  не  тільки  концентрацією  останніх,  а   й
       експресією переносника.
            Останнім часом з`явилися  роботи,  що  засвідчують,  що  білок,
       асоційований з загальною лікарською резистентністю (MRP але  не  Pgp)
       може функціонувати як ГS-Х-помпа [36,37]. Ця гіпотеза підтверджується
       такими фактами: 1) клітини,  що  гіперекспресують  MRP  секретують  у
       культуральне   середовище    більше    глутатіона;    2)    витощення
       внутрішньоклітинного глутатіона за допомогою BSO запобігає  виведенню
       ліків з клітин за допомогою MRP;  3)  гіперекспресія  MRP  відповідає
       підсиленому АТФ-залежному транспорту кон`югатів  ГS-Х; 4) антитіла до
       MRP реагують  з  білком  з  молекулярною  масою  190  кД,  який  може
       зв`язуватись з ГS-кон`югатами та лейкотрієном С4.
            Таким чином, видалення з клітин комплексів  глутатіон-S-платина
       переносниками  з  активністю   ГS-Х-помпи   є   важливим   механізмом
       резистентності,   завдяки   якому   внутрішньоклітинна   концентрація
       препарату підтримується на низькому рівні, що сприяє  зменшенню  його
       пошкоджуючого ефекту.



            4.2.Внутрішньоклітинні тіолові детоксикуючі системи


            4.2.1. Система глутатіона


            Глутатіон та ферменти його метаболізму є  важливими  елементами
       меxанізму резистентності клітин до алкілуючих агентів, в  тому  числі
       сполук платини.
            Більшість  клітинних  ліній,  резистентних  до  дії  цисплатина
       відрізняються  підвищеним  вмістом  внутрішньоклітинного   глутатіона
       та/чи гіпреактивністю  фермента,  що  ініціює  синтез  глутатіона  ?-
       глутамілцистеінсинтетази  (?-ГЦС)  [38-40].  Однак  описані  приклади
       стійких до дії цисплатина клітинних ліній  з  нормальним  [41,42]  та
       зниженим [43] у порівнянні з чутливими лініями вмістом глутатіона.
            Сучасні стереоскопічні  та  спректроскопічні  методи  дозволили
       визначити,  що  глутатіон  та  цисплатин  реагують  безпосередньо   у
       безклітинній  системі  в  молярному  співвідношенні  2/1,   утворюючи
       хелатний комплекс диглутатіонплатини. Після 12 годин інкубації клітин
       в  середовищі  з  цисплатином  концентрація   ГS-Pt-кон`югатів   стає
       максимальною. При цьому 60% внутрішньоклітинної платини знаходиться у
       зв`язаному стані [10].
            Заслуговують  на  увагу  дані,  отримані  в   експериментах   з
       використанням  інгібітора  синтезу  глутатіона  бутіонінсульфоксиміна
       (BSO). Обробка BSO клітинних ліній раку шлунка людини MKN-28 та  MKN-
       45 , раку яєчника КК  та  МН,  аденокарциноми  ротової  порожнини  КВ
       призводить  до  сенсибілізації  клітин  до  дії  цисплатина  [44,45].
       Причому витощення внутрішньоклітинного глутатіона за допомогою BSO не
       впливало на акумулювання цисплатина в  клітинах  а  також  формування
       кон`югатів GSH-Pt [46].
            При вивчeнні взаємодії ферментів метаболізму глутатіона  та  їх
       ролі в механізмах резистентності велике значення мають експерименти з
       використанням  культур  клітин,  трансфекованих  генами   відповідних
       ензимів. Наприклад, клітини раку легенів людини, трансфековані  геном
       фермента ?-ГЦС,  мають  у  2  рази  більше  глутатіона,  в  1,6  рази
       підвищену активність ГS-Х-помпи  та  в  1,5  рази  меньшу  акумуляцію
       цисплатина,  в  6,7  рази  більшу  резистентність  до  цисплатина   у
       порівнянні    з    батьківською    клітинною    лінією.     Витощення
       внутрішньоклітинного глутатіона в трансфектах  за  допомогою  BSO  не
       впливало на резистентність до цисплатина. У таких випадках зберіглась
       висока активність ГS-X-помпи і тому  внутрішньоклітинна  концентрація
       платини  не  змінилася.  Таким  чином,  в  даній  клітинній   системі
       резистентність обумовлена  посиленим  видаленням  ГS-Pt-конюгатів  за
       допомогою ГS-Х-помпи, що не  загубила  своєї  активності  навіть  при
       витощенні субстрата (глутатіона) [47].
            В той же час не винайдено ніякого зв`язку між рівнем  експресії
       глутатіонредуктази  та  глутатіонпероксидази  та  ступенем  стійкості
       клітин до дії цисплатина [48,49].



            4.2.2.Металотеонеіни


            Особлива   роль   у   формуванні   резистентності   відводиться
       металотеонеінам.
            Оскільки   у   вільному   стані   ці   сполуки    нуклеофільні,
       металотеонеіни   зв`язуються   з   електрофільними    протипухлинними
       препаратами  типу  цисплатина,  а   також   мелфаланом   та   деякими
       антибіотиками: адріаміцином, блеоміцином та доксорубіцином.
            Клітини, що гіперексперсують металотеонеіни, часто  резистентні
       до дії цисплатина [50,51].  Однак  металотеонеін  не  є  обов`язковим
       компонентом резистентності до цього препарату, оскільки зустрічаються
       резистентні до цисплатина клітинні лінії,  в  яких  металотеонеін  не
       виявляється [43].
            При обробці цисплатином  резистентних  до  препарата  клітин  з
       підвищеним вмістом  металотеонеіна  70%  внутрішньоклітинної  платини
       знаходять у зв`язаному з білком стані.
            Досліди по трансфекції гена  металотеонеіна  ІІа  показали,  що
       клітини-трансфекти   набувають    резистентності    до    цисплатина,
       хлорамбуцила та мелфалана [52].
            Добре виражена експресія металотеонеіна в  пухлинах  може  мати
       прогностичне  значення.  Наприклад,  при  лікування  хворих  на   рак
       стравоходу за допомогою цисплатина 5-річна життєздатність пацієнтів з
       металотеонеін-від`ємними  пухлинами  становить  56%,  а  пацієнтів  з
       металотеонеін-позитивними пухлинами – 26% [53].
            З  наведених  вище  даних  можна  заключити,  що   у   випадках
       підвищеної   експресії    металотеонеін    є    важливою    складовою
       резистентності до цисплатина.


            4.3.Репарація пошкоджень ДНК.

            Резистентність клітин до дії цисплатина може залежати від стану
       системи репарації пошкоджень ДНК.
            Один  з  механізмів  резистентності  клітин  до  цисплатину   –
       прискорена  репарація  цисплатин-ДНК-адуктів  [54].  Чутливі  до  дії
       цисплатина   клітинні   лінії   відрізняються   зниженою    здатністю
       ліквідувати основні адукти ДНК та  цисплатина  (GG-Pt  та  GA-Pt),  а
       також   послабленою   активністю   ДНК-полімераз   [55,56].   Обробка
       резистентних до цисплатина  клітин  афідикоіном  –  інгібітором  ДНК-
       полімераз  ? та  ? повертає чутливість до  цисплатина,  що  стверджує
       роль репарації  адуктів  цисплатин-ДНК  у  формуванні  резистентності
       [57].
            На сьогодні мало відомо, щодо ліквідації продуктів платинування
       ДНК у мітохондріях. Вважають, що мітохондріальна ендонуклеаза G (Endo
       G) може брати участь у репаративних процесах  цих органел [58].
            Нещодавно  з   культуральної   рідини   пухлинних   клітин   та
       біопсійного матеріалу пухлин людини були виділені  білки  HMG  (high-
       mobility group)  та їм подібні, які зв`язуються з ДНК, що  пошкоджена
       цисплатином, але не трансплатином чи  ультрафіолетовим  випроміненням
       [59,60]. Ці білки – висококонсервативні, локалізуються  у  цитоплазмі
       та  ядрі  клітини.  Їх  біологічна  роль  ще  точно  не  встановлена.
       Інтенсивність зв`язування ДНК з цисплатином та HMG-подібними  білками
       прямо пропорційна ступеню пошкодження ДНК.  ДНК  резистентних  клітин
       зв`язується з цими білками більш ефективно. HMG-білки  взаємодіють  з
       платинованою  ДНК,  закривають   пошкоджені   сайти   від   ферментів
       ексцизійної  репарації.  Припускають,  що  зв`язування   HMG-подібних
       білків  з  пошкодженою  ДНК  може  викликати  зупинку  реплікації  чи
       транскрипції, а також впливати на роботу систем  контролю  клітинного
       циклу при руйнуванні ДНК.
            Відомо, що  такі  дефекти  системи  репарації  невідповідностей
       (mismatch repair), як недостатня експресія білків  hMSH2  чи  hMLH-1,
       призводять до виникнення резистентності до цисплатина [61,62].  MSH2-
       білок сам по собі чи разом  з  білком  GTBP/p160  розпізнає  невеликі
       зміни  у  ланцюгу  ДНК,  наприклад,  продукти  платинування  ДНК,   і
       зв`язується з ними.
            Априорі можна було б  припустити,  що  відсутність  якої-небудь
       частини системи репарації ДНК сприяє розвитку гіперчутливості до  дії
       цисплатина,  що  відбувається  у  клітинах,  дефектних  за   системою
       ексцизійної  репарації.  Але  у  випадку  порушення  функції  системи
       mismatch repair клітина набуває  резистентності  до  цисплатина.  Цей
       феномен можна розглядати з двох позицій. По-перше, порушення  системи
       mismatch  repair  може  бути   наслідком   індукованого   цисплатином
       випадкового мутагенезу, що в результаті обумовлює  стійкість  до  дії
       цисплатина. По-друге, саме дефект у  роботі  цієї  системи  репарації
       може покласти початок резистентності [63,64].
            Комплекс білків репарації “розпізнає” адукти у  ланцюгу-шаблоні
       ДНК та намагається виправити ланцюг, що синтезується [65]. Так,  поки
       існує адукт у ланцюгу-шаблоні,  а  підбір  нових  основ  не  ліквідує
       невідповідність, що існує, генерується сигнал, який запускає програму
       апоптозу. Якщо система mismatch repair не  працює,  такий  сигнал  не
       генерується, клітини стають толерантними до адуктів цисплатин-ДНК  та
       набувають резистентного фенотипу.
            У   випадку    порушення    системи    ексцизійної    репарації
       спостерігається  протилежний  ефект.  Клітини,  дефектні  по  системі
       ексцизійної репарації значно більш чутливі  до  дії  цисплатина,  ніж
       нормальні клітини [66].
            Показано,  що  цисплатин  індукує   експресію   важливого   для
       ексцизійної репарації гена  ERCC-1.  Але  до  активації  гена  ERCC-1
       відбувається активації генів c-fos та c-jun, а  також  фосфорилювання
       білка c-Jun [67].
            Нещодавно був відкритий новий ген BRCA1, повязаний з репарацією
       пошкодженої ДНК. Показано, що гіперекспресія цього  гена  в  клітинах
       рака яєчника та молочної залози асоційована з резистентністю  до  дії
       цисплатина [68].
            Топоізомерази І та ІІ, що релаксують спіралі ДНК,  є  важливими
       ферментами реплікації, транскрипції та рекомбінації. Вони  відіграють
       суттєву роль у процесах усунення адуктів  ДНК-цисплатин.  У  багатьох
       резистентних до дії  цисплатина  клітинах  спостерігається  підвищена
       активність топоізомерази ІІ [69]. Інгібітори топоізомераз  І  та  ІІ:
       етопозид,  камтотецин,  СРТ-11,  SN-38,   новобіоцин   –   викликають
       сенсибілізацію резистентних клітин до дії цисплатина [70-72].
            Ще одним механізмом резистентності до цисплатина на  рівні  ДНК
       може  бути  підвищена  концентрація  в  клітині  вільних  нуклеотидів
       (наприклад,  АТФ,  АДФ),  які  конкурують  з  ДНК  за  зв`язування  з
       цисплатином [73]. Таким чином, вільні нуклеотиди, концентрація яких у
       цитоплазмі відрізняється в різних клітинах, можуть значно впливати на
       чутливість пухлин до цисплатина.
            Важливо також розглянути утворення зшивок  ДНК-білок  під  дією
       цисплатина. Хоча кількість цих адуктів набагато менше, ніж у разі між-
         та  внутри-  ланцюгових  зшивок,  але  відмічено,  що  вони   також
       відповідальні за  цитотоксичний  ефект  цисплатина.  Наприклад,  було
       показано, що одна резистентна до дії цисплатина клітинна  лінія  раку
       яєчника утримувала у 6  разів  менше  цитокератина  18,  ніж  чутлива
       лінія. Трансфекція кДНК цитокератина 18 в клітини резистентної  лінії
       давала клони з підвищеним рівнем цього білка та у більшості  випадків
       з чутливим фенотипом. При цьому було встановлено,  що  після  обробки
       цисплатином, з ДНК у клітинах зв`язуються негістонові білки.  Пізніше
       ці білки  було  ідентифіковано  як  цитокератини  [74].  Можливо,  що
       формування  зшивок  цитокератин-ДНК,  асоціюється  з  цитотоксичністю
       цисплатина. Тоді зменшення продукції цитокератина 18  у  резистентних
       клітинах  веде  до  зменшення  кількості  зшивок  білок-ДНК  та,   як
       наслідок, зниження чутливості до цисплатина.
            Виходячи з вищенаведеного, можна заключити,  що  резистентність
       до дії цисплатина  на  рівні  ДНК  обумовлена  підвищеною  активністю
       систем репарації клітини чи  її  толерантністю  до  існуючих  ДНК-Pt-
       адуктів.


            4.4.Зміни  генома,   що   асоційовані   з   резистентністю   до
       цисплатина.

            Оскільки клітинна резистентність є стійко спадковою  ознакою  в
       ряду поколінь, можна зробити висновок, що стійкість до дії цисплатина
       визначається генетичними особливостями клітини.
            Встановлено, що основна роль в цьому феномені належить 11-й  та
       16-й хромосомам  у  людини  [75].  На  клітинних  гібридах  з  різним
       хромосомним   складом   було   показано,   що   обовязковою    умовою
       резистентного фенотипа є  наявність  16-ї  хромосоми  з  резистентних
       клітин та 11-ї хромосоми з чутливих клітин. При  цьому  основну  роль
       грає 16-та хромосома, а 11-та хромосома необхідна для її  нормального
       функціонування. Ці хромосоми залучені у різні боки резистентності. На
       16-тій хромосомі присутні гени  MRP (multidrug resistance  associated
       protein), LRP  (lung  resistance  protein),  гени  додаткового  білка
       ексцизійної   репарації-4,   металотеонеіна.   На   11-їй   хромосомі
       розташовані гени, що кодують глутатіон трансферазу ? (ГSТ-?), а також
       протеін, що розпізнає специфічні послідовності пошкодженої ДНК.
            Чутливість пухлинних клітин до дії цисплатина може залежати від
       функціональної активності генів р 53 та генів родини bcl.
            На сьогодні все ще залишається відкритим  питання  про  зв`язок
       лікарської резистентності з р 53-статусом клітин. Невизначеність  тут
       існує тому, що роль білка Р 53 у хемочутливості клітин до  лікарської
       терапії розглядають з двох протилежних точок зору: 1) експресія білка
       Р 53 дикого типу (wt  p  53)   збільшує  чутливість  до  хіміотерапії
       шляхом прискорення входження клітин в  апоптоз;  2)  білок  wt  P  53
       зменшує хемочутливість,  оскільки  після  пошкодження  ДНК  обумовлює
       зупинку росту для репарації ДНК [76].
            Відомо,  що  після   дії   цисплатина   у   чутливих   клітинах
       збільшується рівень експресії гена р 53 та відповідно – білка Р 53. Р
       53 індукує експресію білка р 21/WAF1/CIP1-інгібітора циклін  залежних
       кіназ, що грає важливу роль у  зупинці  клітинного  циклу  у  G1-фазі
       після генотоксичного стресу [77,78]. Під час  цієї  зупинки  клітиною
       приймається  “рішення”:  репарувати  ДНК  чи  входити  в  апоптоз,  в
       залежності від глибини  пошкодження.  На  сьогодні  ще  невідомі  усі
       біохімічні подробиці того, як активація р 53 ініціює апоптоз.
            Більшість робіт по вивченню функціональної активності  Р  53  у
       резистентних до дії цисплатина клітинах засвідчують, що мутації  гена
       р 53 призводять до розвитку резистентності до  хіміотерапії  [79-82].
       Показано,    що    в    резистентних    клітинах    часто    порушена
       внутрішньоклітинна  локалізація  білка  Р  53   [83]   а   також   не
       відбувається індукція експресії Р 53 та  р  21  цисплатином  [84,85].
       Досліди по трансфекції гена р 53 також довели, що перенос у  дефектні
       за функцією Р 53 чи null-клітини  wt  p53-гена  обумовлює  збільшення
       чутливості до лікарських препаратів, а  трансфекція  мутантного  гена
       mut p 53 спричиняє розвиток резистентності [86].
            Досліджено, що в клітині після дії  цисплатина  разом  з  р  53
       індукується експресія гена mdm 2. Продукт даного  гена  відрізняється
       властивістю  утворювати  комплекси  з  білком  Р  53  ,  таким  чином
       дезактивуючи частину внутрішньоклітинного Р  53.  В  резистентних  до
       цисплатина клітинах іноді спостерігається гіперекспресія гена  mdm  2
       [87] а використання антисмислових (проти mdm 2) нуклеотидів  у  такій
       системі призводить до збільшення  чутливості  до  лікарської  терапії
       [88].
            Таким чином, функція Р 53 може бути інактивована двома шляхами:
       мутаціями   безпосередньо   гена   р   53    а    також    підвищеним
       комплексоутворенням Р 53 з MDM 2.
            Але  дані  деяких  досліджень  заперечують,  що  мутації  р  53
       обов`язково спричиняють розвиток лікарської резистентності. Feudis  з
       співавторами показали, наприклад, на 9 клітинних лініях раку  яєчника
       з різним р 53- статусом, що в  цих  клітинних  лініях  після  обробки
       цисплатином рівень експерсії  р  21  підвищується  однаковo  і  немає
       різниці  у  чутливості  до  апоптозу,  індукованого  дією   препарата
       [89,90].
            Однак відомо, що більш половини злоякісних новоутворень  людини
       відрізняються мутаціями р 53,  i  ця  ознака  є  важливим  показником
       чутливості пухлин до  хіміотерапії  [91].  У  клінічних  дослідженнях
       показано, що рівень експресії р 53 у  зразках  біопсійного  матеріала
       при  раку  шлунка  та  яєчників  може  бути  важливим   прогностичним
       показником захворювання [92]. Досліджено, що Р 53-позитивний  фенотип
       пухлин асоціюється з поганим прогнозом [93,94]. Це  пояснюється  тим,
       що мутантна форма білка має подовшений час напівжиття  і  тому  легше
       виявляється імуногістохімічно.
            Білки родини Bcl (Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-Xs, Bax  та  інші)  грають
       важливу роль у регуляції процесу апоптоза. Деякі з них (Bcl-Xl,  Bcl-
       2) гальмують розвиток апоптоза, тоді як інші  (Bcl-Xs,  Bax,  Bak)  –
       навпаки є промоторами цього процесу. Відомо, що  білки  даної  родини
       здатні  гетеродимеризуватись,  утворюючи  умовний   “реостат”,   який
       регулює функціональну активність білків [95].  Досліджено,  що  білки
       Bcl-2  та  Bcl-Xl  гіперекспресовані   при   багатьох   неопластичних
       захворюваннях  людини.  Причому  така  гіпрекспресія  асоційована   з
       резистентністю пухлинних клітин in vitro до протипухлинних препаратів
       [96].  Така  стійкість  клітин  пов`язана  з  порушенням   механізмів
       індукції апоптозу у відповідь на  лікарську  терапію.  У  дослідах  з
       використанням клітин  траксфекованих  генами  bcl-2  чи  bcl-xl  було
       показано, що трансфекти набувають резистентний фенотип до цілого ряду
       лікарськиї препаратів включаючи цисплатин [97,98]. У таких  модельних
       клітинах  була  значно  зменшена   деградація   ДНК   після   обробки
       цисплатином. Якщо порівнювати внесок продуктів генів bcl-2 та  bcl-xl
       у антиапоптозному ефекті, то показано, що білок  Bcl-Xl  має  більший
       вплив [99].
            Після обробки цисплатином у чутливих  клітинах,  що  входять  в
       апоптоз, не змінюється рівень експресії білків Bcl-2, Bcl-Xl  та  Bax
       (24kDa), але підвищується рівень білків Bak та Bax  (21  kDa),  тобто
       білків-агоністів   апоптозау   [100-102].   Відомо,   що   в   деяких
       резистентних до цисплатина клітинних лініях спостерігається  знижений
       рівень  експресії  Bax  [103],  а  трансфекція  гена  bax   спричиняє
       підвищення  чутливості  до  хіміотерапії  [104].  А  от   клітини   з
       підвищеною експресією Bak відрізняються  більшою  чутливістю  до  дії
       цисплатина [105].
Відомо, що білок Bcl-2 часто гіперекспресований у пухлинах людини. Причиною
такої гіперекспресії вважають часті ділеції великих нетрансльованих
послідовностей з 3 та 5 – кінців гену bcl-2 (78-А).  Дещо  суперечливі  дані
       імуногістохімічних досліджень експресії білків родини Bcl  у  зразках
       біопсійного  матеріалу  та  прогнозування  чутливості  до  лікарської
       терапії  у  порівнянні  з  дослідженнями  in  vivo.  Наприклад,  одні
       дослідники повідомляють, що Вcl-2-позитивні  неоплазії  мають  слабку
       відповідь на  хіміотерапію  та  поганий  прогноз  [106,107],  інші  –
       навпаки, спостерігають, що експресія Вcl-2 у пухлинах  асоціюється  з
       покращеним виживанням [108]. Експресія  Вax  окремо  не  має  ніякого
       прогностичного значення [109].
            Роботи, зроблені з використанням резистентних до дії цисплатина
       лініях клітин показали важливість онкогена fos  в  резистентності  до
       цього препарату. В резистентних лініях клітин спостерігали підвищений
       рівень експресії гена fos. Були визначені дві важливі  функції   Fos-
       білка: транскрипційна активація синтеза ДНК та  участь  у  клітнинній
       проліферації. Fos-білок контролює клітинну відповідь  на  пошкодження
       ДНК цисплатином через активацію генів топоізомерази І,  полімерази  ?
       та металотеонеіна [2].
            Повідомляється про те, що гіперекспресія супресорного  гена  nm
       23  супроводжується,  як  правило,  збільшенням  чутливості  до   дії
       цисплатина.  Дані  результати  отримано  з  досліджень  in  vitro  на
       клітинних лініях карциноми молочної залози людини  MDA-MB-435,  лінії
       карциноми яєчника OKAR-3 та лінії меланоми  К-1735-ТК,  а  також  при
       дослідженні клінічного  матеріалу  пухлин  молочної  залози.  У  всіх
       досліджуваних системах гіперекспресія nm 23 призвела до формування  у
       клітинах великої кількості міжланцюгових  зшивок  ДНК  та  збільшення
       чутливості до цисплатина [110].
            Цікавими  є  дані  по  переносу  резисткнтного  до   цисплатина
       фенотипу при трансфекції генів v-src. Непухлинні епітеліальні клітини
       людини HAG-1 після трансфекції  гену  v-src  набували  неопластичного
       фенотипу та резистентності до цисплатина. У трансформованих  клітинах
       спостерігали значне зменьшення формування міжланцюгових зшивок ДНК  з
       їх  послідовним  швидким  видаленням.  Після  обробки  даних   клітин
       інгібіторами   src-кіназ   знижувався   рівень   резистентності    до
       цисплатина. Результати цієї  роботи  вказують  на  можливість  участі
       продукту гена v-src в індукції  резитентності  до  цисплатина  шляхом
       модуляції деяких шляхів репарації ДНК [111].
            Ампліфікація   гена   сорцина   (кальцій-звязуючого   білка   з
       молекулярною масою 19-22кД) в деяких модельних системах  асоціювалася
       з  резистентним  фенотипом  [112].  Важко   зараз   сказати,   чи   є
       резистентність пов`язаною саме з сорцином чи разом з геном сорцина  у
       клітинах  ампліфіковані  і   інші,   більш   важливі   для   розвитку
       резистентності гени.
            Таким  чином  резистентність  до  цисплатина  має   комплексний
       характер  і  пов`язана  з  рядом   особливостей   клітин   на   рівні
       цитоплазматичної мемрани,  внутрішньоклітинних  систем  детоксикації,
       систем репарації та порушення функціональної активності генів  p  53,
       bcl-2, fos, mdm 2, nm23та інших.



            Список літератури

    1. Чехун ВФ. Роль плазматичних мембран нормальних і пухлинних  клітин  в
       механізмі  реалізації  цитотоксичних  ефектів  координаційних  сполук
       платини [Автореф дис ... докт мед наук]. Киев: ИЭПОР, 1994. 40 сс.
       2.  Scanlon  KJ,  Kashani-Sabet  M,  Tone  T,  Funato  T.   Cisplatin
       resistance in human cancers. Pharmacol Ther 1991; 52:385-406.
       3. Gately DP,  S.B.Howell SB. Cellular accumulation of the anticancer
       agent cisplatin. Br J Cancer 1993; 67:1171-6.
       4. Ohmori T,  Morikage T. The mechanism of the difference in cellular
       uptake of platinum derivatives in non-small  cell  lung  cancer  cell
       line (PC-14) and its cisplatin-resistant subline (PC-14/CDDP). Jpn  J
       Cancer Res 1993; 84: 83-92.
       5. Scanlon KJ, Safistein RL, Thies H, Gross RB, Waxman S,  Guttenplan
       JB.    Inhibition    of    amino    acid    transport     by     cis-
       diamminedichloroplatinum (II) derivatives in  L1210  murine  leukemia
       cells. Cancer Res  1983; 43: 4211-5.
       6.   Andrews   PA,   Velury   S,   Mann   SC,   Howell    SB.    Cis-
       diamminedichloroplatinum II accumulation in sensitive  and  resistant
       human ovarian carcinoma cells. Cancer Res 1988; 48: 68-73.
       7.  Richon  VM,   Schulte  N,  Eastman  A.  Multiple  mechanisms   of
       resistance to cis-diamminedichloroplatinum (II)  in  murine  leukemia
       L1210 cells. Cancer Res  1987 47: 2056-61.
       8. Zaman GJR,  Lakelma  J,   Tellingen  O,   Beijnen  J,   Dekker  H,
       Paulusma C, Oude Elferink RPJ, Baas F, Borst P. Role  of  glutathione
       in the export of compaunds from cells  by  the  multidrug-resistance-
       associated protein. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92:7690-4.
       9. Muller V, Meijer C, Zaman GJR. Overexpression of the gene encoding
       the multidrug resistance-assiciated  protein results in increased ATP-
       dependent glutathione S-conjugate transport. Proc Natl Acad  Sci  USA
       1994; 91: 13033-7.
       10.   Ishikawa   T,   Ali-Osman   F.   Glutathione-associated    cis-
       diamminedichloroplatinum (II)  metabolism  and  ATP-dependent  efflux
       from leukemia cells. J Biol Chem 1993;  268: 20116-25.
       11. Laurent G, Erickson LC, Sharkey NA, Kohn  KW.  DNA  cross-linking
       and cytotoxicity  induced  by  cis-diamminedichloroplatinum  (II)  in
       human normal and tumor cell lines. Cancer Res  1981; 41: 3347-51.
       12. Sorenson CM, Barry MA, Eastman A. Analysis of  events  associated
       with cell cycle  arrest  at  G2  phase  and  cell  death  induced  by
       cisplatin. J Natl Cancer Inst  1990;  82: 749-55.
       13. Olivero OA, Chang PK, Lopez-larraza DM, Semino-Mora  MC,  Poirier
       MC. Preferential formation and  decreased  removal  of  cisplatin-DNA
       adducts in chinese hamster ovary cell mitochondrial DNA  as  compared
       to nuclear DNA. Mutat Res 1997, 391(1-2): 79-86.
       14. Giurgiovich AJ, Diwan BA,  Olivero  OA,  Anderson  LM,  Rice  JM,
       Poirier MC. Elevated mitochondrial cisplatin-DNA adduct levels in rat
       tissues after transplacental cisplatin exposure. Carcinogenesis 1997,
       18(1): 93-6.
       15. Gorczyca W, Gong I, Ardelt B, Traganos F,  Darzynkiewicz  Z.  The
       cell cycle related differences in susceptibility of  HL-60  cells  to
       apoptosis induced by  various  antitumor  agents.  Cancer  Res  1993,
       53(13): 3186-92.
       16. el Alaoui S, Lawry J, Griffin M. The cell cycle and induction  of
       apoptosis in a hamster fibrosarcoma cell line treated with anticancer
       drugs: its importance to solid tumor chemotherapy. J Neurooncol 1997,
       31(1-2): 195-207.
       17. Vaisman A, Varchenko M, Said I, Chaney  SG.  Cell  cycle  changes
       associated  with  formation  of  Pt-DNA  adducts  in  human   ovarian
       carcinoma cells with different cisplatin sensitivity. Cytometry 1997,
       27(1): 54-64.
       18. Nishio K, Saigo N. Effect of cisplatin on cell cycle  regulators.
       Gan To Kagaku Ryoho 1994, 21(3): 289-94.
       19. Dimanche-Boitrel MT, Micheau O,  Hamman  A,  Haugg  M,  Eymin  B,
       Chauffert B, Solary E. Contribution of  the  cyclin-dependent  kinase
       inhibitor p27KIP1 to the confluence-dependent  resistance  of  HT  29
       human colon carcinoma cells. Int J Cancer 1998, 77(5): 796-802.
       20. Gill JS, Mindebank AJ. Cisplatin-induced apoptosis in rat  dorsal
       root ganglion neurons is associated with  attempted  entry  into  the
       cell cycle. J Clin Invest 1998, 101(12): 2842-50.
       21.  Megyesi  J,  Safirstein  RL,  Price  PM.  Induction  of   p   21
       WAF1?CIP1/SDI1 in kidney tubule cells affects the course of cisplatin-
       induced acute renal failure. J Clin Invest 1998, 101(4): 777-82.
       22. Otto AM, Paddenberg  R,  Schubert  S,  Mannherz  HG.  Cell  cycle
       arrest, micronucleus formation, and cell death in  growth  inhibition
       of MCF-7 breast cancer cells by tamoxifen and cisplatin. J Cancer Res
       Clin Oncol 1996, 122(10): 603-612.
       23. Boersma AW, Nooter K, Oostrum RG,  Stoter  G.  Quantification  of
       apoptotic cells with fluorescein isothiocyanate-labeled annexin V  in
       chinese  hamster  ovary  cells  cultures  treated   with   cisplatin.
       Cytometry 1996, 24(2): 123-130.
       24. Ormerod MG, O`Neill C, Robertson D, Helland LR, Harrap  KR.  Cis-
       diamminedichloroplatinum (II)-induced cell death through apoptosis in
       sensitive and resistant human ovarian carcinoma  cell  lines.  Cancer
       Chemother Pharmacol 1996, 37(5): 463-471.
       25. Uslu R, Jewett A, Bonavida  B.  Sensitization  of  human  ovarian
       tumor  cells  by  subtoxic  CDDP  to   anti-fas   antibody   mediated
       cytotoxicity and apoptosis. Gynecol Oncol 1996, 62(2): 282-91.
       26. Fulda S, Sieverts H, Friesen C, Herr I, Debatin KM. The CD95(APO-
       1/Fas) system mediates drug-induced apoptosis in neuroblastoma cells.
       Cancer Res 1997, 57(17): 3823-9.
       27. McGahon AJ, Costa Pereira AP, Daly L, Cotter TG. Chemotherapeutic
       drug-induced apoptosis in human leukaemic cells is independent of the
       Fas(APO-1/CD95) receptor/ligand system. Br J Haematol  1998,  101(3):
       539-47.
       28. Antoku K, Liu Z, Johnson DE. Inhibition of caspase  proteases  by
       CrmA enhances the resistance of  human  leukemia  cells  to  multiple
       chemotherapeutic agents. Leukemia 1997, 11(10): 1665-72.
       29. Chen Z, Naito M,  Mashima  T,  Tsuruo  T.  Activation  of  actin-
       cleavable interleukin 1 beta-converting enzyme (ICE) family  protease
       CPP-32 during chemotherapeutic  agent-induced  apoptosis  in  ovarian
       carcinoma cells. Cancer Res 1996, 56(22): 5224-9.
       30. Marissen WE, Lloyd RE. Eukariotic translation  initiation  factor
       4G  is  targeted  for  proteolytic  cleavage  by  caspase  3   during
       inhibition of translation in apoptotic cells.  Mol  Cell  Biol  1998,
       18(12): 7565-74.
       31. Kraker AJ, Moore CW. Accumulation of cis-diamminedichloroplatinum
       (II) and platinum analogues  by  platinum-resistant  murine  leukemia
       cells in vitro. Cancer Res 1988; 48: 9-13.
       32. Eichholtz-Wirth H, Hietel B. The relationship  between  cisplatin
       sensitivity and drug uptake into  mammalian  cells  in  vitro.  Br  J
       Cancer 1986; 54: 239-43.
       33. Kawai K,  Kamatani N,  Georges E,  Ling V.  Identification  of  a
       membrane glycoprotein  overexpression  in  murine  lymphoma  sublines
       resistant to cis- diamminedichloroplatinum (II). J  Biol  Chem  1990;
       265: 13137-42.
       34. Ishikawa T, Wright CD, Ishizuka  H.  GS-X  pump  Is  functionally
       overexpressed in  cis-diamminedichloroplatinum  (II)-resistant  human
       leukemia HL-60 Cells and downregulated  by  cell  differentiation.  J
       Biol Chem  1994;  269: 29085-93.
       35. Goto S, Yoshido K, MoriKawa T,  Urata  Y,  Suzuki  K,.  Kondo  T.
       Augmentation  of  transport  for  cisplatin-glutathione   adduct   in
       cisplatin-resistant cancer cells. Cancer Res 1995;  55: 4297-301.
       36.  Veneroni  S,  Zaffaroni  N,  Daidone  MG,  Benini  E,  Villa  R,
       Silvestrini R. Expression of P-glycoprotein and in vitro or  in  vivo
       resistance  to  doxorubicin  and  cisplatin  in  breast  and  ovarian
       cancers. Eur J Cancer  1994;  30A: 1002-7.
       37. Jedlitschky G, Leier J, Buchholz U, Barnouin K, Kurz  G,  Keppler
       D. Transport of glutathione, glucuronate, and sulfate  conjugates  by
       the MRP gene-encoded conjugate export pump. Cancer Res  1996; 56: 988-
       94.
       38.  Okuyama T, Maehara Y, Endo  K,  Baba  H,  Adachi  Y,  Kuwano  M,
       Sugimachi  K.   Expression  of   glutathione   S-transferase-pi   and
       sensitivity of human gastric cancer cells to cisplatin. Cancer  1994;
        74: 1230-6.
       39. Awasthi S, Sharma R, Singhal SS, Herzog NK,  Chaubey  M,  Awasthi
       YC. Modulation of cisplatin  cytotoxicity  by  sulphasalazine.  Br  J
       Cancer  1994;  70: 190-4.
       40. Bongers V, Snow GB, Braakhuis BJM. The  role  of  glutathione  S-
       transferases in head and neck squamous  cell  carcinogenesis.  Eur  J
       Cancer  1995;  31B: 349-54.
       41 Minagawa Y,  Kigawa  J,  Ishihara  H,   Itamochi  H,  Terakawa  N.
       Synergistic enhancement of cisplatin cytotoxicity by SN-38, an active
       metabolite of CPT-11,  for  cisplatin-resistant  HeLa  cells.  Jpn  J
       Cancer Res  1994;  85: 966-71.
       42. Boscia RE, Korbut T, Holden SA, Ara G, Teicher BA. Interaction of
       topoisomerase    I    inhibitors    with    radiation     in     cis-
       Diamminedichloroplatinum (II)-sensitive and -resistant cells in vitro
       and in the FSAIIC fibrosarcoma in vivo. Int J Cancer  1993;  53: 118-
       23.
       43. Kikuchi Y, Hirata J, Yamamoto K, Ishi K, Kita T, Kudoh  K,   Tode
       T, Nagata  I,  Taniguchi  K,  Kuwano  M.  Altered  expression  of  ?-
       glutamylcysteine synthetase, metallothionein and topoisomerase  I  or
       II during acquisition  of  drug  resistance  to  cisplatin  in  human
       ovarian cancer cells. Jpn J Cancer Res  1997;  88: 213-7.
       44. Hirata J, Kikuchi Y, Kita T, Imaizumi EE, Tode T, Ishii K,  Kudoh
       K, Nagata I.  Modulation of sensitivity of human ovarian cancer cells
       to cis-diamminedichloroplatinum (II) by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-
       acetate and D,L-Buthionine-S,R-Sulphoximine. Int J Cancer 1993;   55:
       521-7.
       45.Sugimoto C, Matsukawa S, Fujieda S, Noda I, Tanaka N,  Tsuzuki  H,
       Saito H. Involvement of intracellular  glutathione  in  induction  of
       apoptosis by cisplatin in a human  pharyngeal  carcinoma  cell  line.
       Anticancer Res 1996; 16: 675-80.
       46. Pendyala L, Perez R, Weinstein A, Zdanowicz J, Creaven PJ. Effect
       of  glutathione  depletion  on  the  cytotoxicity  of  cisplatin  and
       iproplatin in a human melanoma cell line. Cancer Chemother  Pharmacol
       1997, 40 (1): 38-44.
       47. Kurokawa H, Nishio K, Ishida T, Arioka H, Fukuoka  K,  Nomoto  T,
       Fukumoto H,  Yokote H,  Saijo N. Effect of glutathione  depletion  on
       cisplatin  resistance  in  cancer  cells  transfected  with  the    ?
       -glutamylcysteine synthetase gene.  Jpn J Cancer Res  1997;  88: 108-
       10.
       48. Campling BG, Baer K, Baker HM, Lam YM. Cole SPC.  Do  glutathione
       and related enzymes play a role in drug resistance in small cell lung
       cancer ctll lines? Br J Cancer  1993;  68: 327-35.
       49. Kodera Y, Akiyama S, Isobe K, Kondo K, Ito K, Yamauchi M,  Takagi
       H. Expression of  ?-glutathione S-transferase gene (GSTP1) in gastric
       cancer:  lack   of   correlation   with   resistance   against   cis-
       diamminedichloroplatinum (II). Eur J Cancer  1994;  30A: 2158-62.
       50. Mellish KJ, Kelland  LR,   Harrap  KR.  In  vitro  platinum  drug
       chemosensitivity of human cervical squamous cell carcinoma cell lines
       with intrinsic and acquired resistance  to  cisplatin.  Br  J  Cancer
       1993;  68: 240-50.
       51.  Eichholtz-Wirth  H,  Reidel  G,  Hietel   B.   Radiation-induced
       transient  cisplatin  resistance   in   murine   fibrosarcoma   cells
       associated with elevated metallothionein content. Br J Cancer   1993;
       67: 1001-6.
       52.  Lazo  JS,  Basu  A.  Metallothionein  expression  and  transient
       resistance to electrophilic antineoplastic drugs. Semin  Cancer  Biol
       1991;  2: 267-71.
       53.  Hishikawa  Y,  Abe  SI,  Kinugasa  S,  Yoshimura  H,  Monden  N.
       Overexpression of metallothionein correlates with chemoresistance  to
       cisplatin and prognosis in esophageal cancer. Oncology  1997; 54: 342-
       7.
       54. Vaisman A, Vachenko M, Said I,  Chaney  SG.  Cell  cycle  changes
       associated  with  formation  of  Pt-DNA  adducts  in  human   ovarian
       carcinoma cells with different cisplatin sensitivity. Cytometry 1997;
       27: 54-64.
       55. Hill  BT,   Scanlon  KJ,   Hansson  J,   Harstrick  A,   Pera  M,
       Fichtinger-Schepman AMJ, Shellard SA. Deficient repair of  cisplatin-
       DNA adducts  identified  in  human  testicular  teratoma  cell  lines
       established from tumours from untreated patients. Eur J Cancer  1994;
        30A: 832-7.
       56. Johnson SW, Swiggard PA, Handel LM, Godwin AK, Ozols RF, Hamilton
       TC. Relationship between platinum-DNA adduct  formation  and  removal
       and cisplatin cytotoxicity in cisplatin-sensitive and resistant human
       ovarian cancer cells. Cancer Res 1994, 54: 5911-6.
       57. Turchi JJ,  Li M, Henkels KM. Cisplatin-DNA  binding  specificity
       of calf high mobility group I protein. Biochem 1996; 35: 2992-3000.
       58.Ikeda S, Ozaki K. Action of mitochondrial endonuclease  G  on  DNA
       damaged    by    L-ascorbic    acid,     peplomycin,     and     cis-
       diamminedichloroplatinum  (II).  Biochem  Biophys  Res  Commun  1997,
       235(2): 291-4.
       59. Bissett D, McLaughlin  K,  Kelland  LR,  Brown  R.  Cisplatin-DNA
       damage recognition proteins in human  tumor  extracts.  Br  J  Cancer
       1993; 67:742-8.
       60. McLaughlin K, Coren G, Masters J, Brown R. Binding activities  of
       cis-platin-damage-recognition proteins in human tumor cell lines. Int
       J Cancer  1993;  53: 662-6.
       61. Brown R, Hirst GL, Gallagher WM, McIlwrath AJ, Margison  GP,  Zee
       AG, Anthoney DA. HMLN1 expression and cellular responses  of  ovarian
       tumor cells to treatment with cytotoxic anticancer  agents.  Oncogene
       1997, 15(1): 45-52.
       62. Lanzi C, Perego P, Supino R, Romanelli S, Pensa  T,  Carenini  N,
       Viano I, Colangelo D, Leone R, Apostoli P, Cassinelli G, Gambetta RA,
       Zunino F. Decreased drug accumulation and increased tolerance to  DNA
       damage in tumor cells with  a  low  level  of  cisplatin  resistance.
       Biochem Pharmacol 1998, 55(8): 1247-54.
       63. Fishel R, Ewel A, Lescoe MC. Purified human MSH2 protein binds to
       DNA containing mismatched nucleotides. Cancer Res 1994; 54: 5539-42.
       64.  Loeb  LA.  Microsatellite  instability:  marker  of  a   mutator
       phenotype in cancer. Cancer Res 1994; 54: 5059-63.
       65. Chu G. Cellular responces to Cisplatin. J Biol Chem   1994;  269:
       787-90.
       66. Sorenson CM, Eastman A. Influence of cis-Diamminedichloroplatinum
       (II) on DNA synthesis and cell cycle progression in  excision  repair
       proficient and deficient hamster ovary  cells. Cancer Res  1988;  48:
       6703-7.
       67. Li Q, Gardner K, Zhang L, Tsang  B,  Bostick-Bruton  F,  Reed  E.
       Cisplatin induction of ERCC-1 mRNA  expression  in  A2780/CP70  human
       ovarian cancer cells. J Biol Chem 1998, 273 (36): 23419-25.
       68. Husain A, He G, Venkatraman ES, Spriggs DR.  BRCA1  up-regulation
       is   associated   with    repair-mediated    resistance    to    cis-
       diamminedichloroplatinum (II). Cancer Res 1998, 58 (6): 1120-3.
       69. Mestdach N,  Pommery  N,  Saucier  JM,  Hecquet  B,   Founier  C,
       Slomianny C, Teissier E, Henichart JP. Chemoresistance to doxorubicin
       and cisplatin in a  murine cell  line.  Analysis  of  P-Glycoprotein,
       topoisomerase  II  activity,   glutathione   and   related   enzymes.
       Anticancer Res 1994;  14: 869-74.
       70. Kondo H,  Kanzawa F,  Nishio K,  Saito S,  Saijo N. In vitro  and
       in vivo effects of cisplatin and etoposide in  combination  on  small
       cell lung cancer cell lines. Jpn J Cancer Res  1994; 85: 1050-6.
       71. Jong S,  Timmer-Bosscha  H,  Vries  EGE,  Mulder  NH.  Effect  of
       novobiocin on cisplatin cytotoxicity and DNA  interstrand  cross-link
       formation in a cisplatin-resistant, small-cell  lung  carcinoma  cell
       line. Int J Cancer  1993;  53: 110-7.
       72.  Guchelaar  H-J,  Timmer-Bosscha  H,  Dam-Meiring  A,  Uges  DRA,
       Oosterhuis JW,  Vries EGE Mulder NH.  Enhancement  of  cisplatin  and
       etoposide cytotoxicity after all-trans retinoic-acid-induced cellular
       differentiation of a murine embryonal  carcinoma  cell  line.  Int  J
       Cancer 1993;  55: 442-7.
       73. Seki S,  Hongo  A,  Zhang  B,  Akiyama  K,  Sarker  AH,  Kudo  T.
       Inhibition   of   cisplatin-mediated   DNA   damage   in   vitro   by
       ribonucleotides. Jpn J Cancer Res  1993; 84: 462-7.
       74.  Parekh  HK,   Simpkins  H.  The   differential   expression   of
       citokeratin 18 in cisplatin-sensitive and  -resistant  human  ovarian
       adenocarcinoma cells  and  its  association  with  drug  sensitivity.
       Cancer Res  1995;  55: 5203-6.
       75. Mirakhur B, Parekh HK,  Simpkins H. Expression of  the  cisplatin
       resistance  phenotype  in  a  human  ovarian  carcinoma   cell   line
       segregates with chromosomes 11 and 16. Cancer Res  1996;   56:  2256-
       62.
       76. Mueller H, Eppeberger U. The dual role of mutant p 53 protein  in
       chemosensitivity of human cancers. Anticancer Res 1996, 16 (6B): 3845-
       8.
       77. Kawasaki t, Tomita Y, Bilim V, Takeda M, Takahashi  K,  Kumanishi
       T. Abrogation of apoptosis induced by DNA-damaging  agents  in  human
       bladder-cancer cell lines  with  p  21/WAF1/CIP1  and/or  p  53  gene
       alterations. Int J Cancer 1996, 68 (4): 501-5.
       78. Kondo S, Barna BP, Kondo Y, Tanaka Y, Casey G, Liu J, Morimura T,
       Kaakaji R, Peterson JW, Werbel B, Barnett GH. WAF1/CIP1 increases the
       susceptibility of p  53  non-functional  malignant  glioma  cells  to
       cisplatin-induced apoptosis. Oncogene 1996, 13 (6): 1279-85.
       79. Li G,  Tang  L,  Zhou  X,  Tron  V,  Ho  V.  Chemotherapy-induced
       apoptosis in melanoma cells is p 53 dependent. Melanoma Res  1998,  8
       (1): 17-23.
       80. Biagosklonny MV, El-Deiry WS. Acute overexpression  of  wt  p  53
       facilitates anticancer drug-induced death of cancer and normal cells.
       Int J Cancer 1998, 75 (6): 933-940.
       81. Li R, Sutphin PD, Schwartz D, Matas  D,  Almog  N,  Wolkowicz  R,
       Goldginger N, Pei H, Prokocimer M, Rotter  V.  Mutant  p  53  protein
       interferes with p 53-independent apoptotic pathways.  Oncogene  1998,
       16 (25): 3269-77.
       82. Vasey PA, Jones NA,  Jenkins  S,  Dive  C,  Broun  R.  Cisplatin,
       camptothecin, and taxol sensitivities of cells with  p  53-associated
       multidrug resistance. Mol Pharmacol 1996, 50 (6): 1536-40.
       83. Vikhanskaya F, Clerico L, Valenti M,  Stazione  NS,  Broggini  M,
       Parodi S, Russo P. Mechanism of resistance to cisplatin  in  a  human
       ovarian-carcinoma cell line selected for resistance  to  doxorubicin:
       possible role of p 53. Int J Cancer 1997, 72 (1): 155-9.
       84. Vaisman A, Varchenko M, Said I, Chaney  SG.  Cell  cycle  changes
       associated  with  formation  of  Pt-DNA  adducts  in  human   ovarian
       carcinoma cells with different cisplatin sensitivity. Cytometry 1997,
       27 (1): 54-64.
       85. Siddik ZH, Mims B, Lozano G, Thai G. Independent pathways of p 53
       induction by cisplatin and X-rays in  a  cisplatin-resistant  ovarian
       tumor cell line. Cancer Res 1998, 58 (4): 698-703.
       86. Ju JF, Banerjee D, Lenz HJ, Danenberg KD, Schmittgen  TC,  Spreas
       CP, Schonthal AH, Manno DJ, Hochhauser D, Bertino JR,  Danenberg  PV.
       Restoration of wild-type p 53  activity  in  p  53-null  HL-60  cells
       confers multidrug sensitivity. Clin Cancer Res 1998, 4 (5): 1315-22.
       87. Fajac A, Da Silva J, Ahomadegbe JC, Rateau JG, Bernaudin JF, Riou
       G, Benard J. Cisplatin-induced apoptosis and p 53 gene  status  in  a
       cisplatin-resistant human ovarian carcinoma cell line. Int  J  Cancer
       1996, 86 (1): 67-74.
       88. Kondo S, Barna BP, Morimura T, Takeuchi J,  Yuan  J,  Akbasak  A,
       Barnett GH. Interleukin-1-beta-converting enzyme mediates  cisplatin-
       induced apoptosis in malignant glioma  cells.  Cancer  Res  1995,  55
       (24): 6166-71.
       89. De Feudis P, Debernardis D, Beccaglia  P,  Valenti  M,  Sire  GE,
       Arzani D, Stanzione S, Parodi S, D`Incalci M, Russo  P,  Broggini  M.
       DDP-induced cytotoxicity is not influenced by  p  53  in  nine  human
       ovarian cancer cell lines with different p 53  status.  Br  J  Cancer
       1997, 76 (4): 474-9.
       90. Burger H, Nooter K, Boersma AW, Kortland CJ, Stoter G. Expression
       of p 53, Bcl-2 and Bax in cisplatin-induced apoptosis  in  testicular
       germ cell tumor cell lines. Br J Cancer 1998, 77 (10): 1562-7.
       91. Ikeguchi M, Tatebe S, Kaibara N, Ito  H.  Changes  in  levels  of
       expression of p 53 and the product of the bcl-2 in lines  of  gastric
       cancer cells during cisplatin-induced apoptosis. Eur Surg  Res  1997,
       29 (5), 396-402.
       92. Pestell  KE,  Medlow  CJ,  Titley  JC,  Kelland  LR,  Walton  MI.
       Characterisation of the p 53 status, BCL-2 expression  and  radiation
       and platinum drug sensitivity of a panel of human ovarian cancer cell
       lines. Int J Cancer 1998, 77 (6): 913-8.
       93. Nakata B, Chung KH, Ogawa M, Yanagawa K,  Muguruma  K,  Inoue  T,
       Yamashita Y,  Onoda  N,  Maeda  K,  Sawada  T,  Sowa.  P  53  protein
       overexpression as a predictor of  the  response  to  themotherapy  in
       gastric cancer. Surg Today 1998, 28 (6): 595-8.
       94. Petty R, Evans A, Duncan I, Kurbacher C, Cree I. Drug  resistance
       in ovarian cancer – the role of p 53. Payhol Oncol Res 1998,  4  (2):
       97-102.
       95. Simonian PL, Grillot DA,  Andrews  DW,  Leber  B,  Nunez  G.  Bax
       homodimerization is not required for Bax to accelarate  chemotherapy-
       induced cell death. J Biol Chem 1996, 271 (50): 32073-7.
       96. Liu JR, Fletcher B, Page C, Hu C, Nunez  G  Baker  V.  Bcl-xL  is
       expressed in ovarian  carcinoma  and  modulates  chemotherapy-induced
       apoptosis. Gynecol Oncol 1998, 70 (3), 398-403.
       97. Miyake H. Hanada N, Nakamura H, Kagawa S, Fujiwara T, Hara I, Eto
       H, Gohji K, Arakawa S, Kamidono S, Saya H. Overexpression of Bcl-2 in
       bladder cancer inhibits apoptosis induced by cisplatin and adenoviral-
       mediated p 53 gebe transfer. Oncogene 1998, 16 (7): 1933-43.
       98. Minn AJ, Rudin CM, Boise LH, Thompson CB.  Expression  of  bcl-xl
       can confer a multidrug resistance phenotype. Blood 1995, 86 (5): 1903-
       10.
       99.Simonian  PL,  Grillot  AM,  Nunez  G.  Bcl-2   and   Bcl-Xl   can
       differentially block chemotherapy induced cell death. Blood 1997,  90
       (3): 1208-16.
       100. Jones NA, Turner J, McIlwrath AJ, Brown R,  Dive  C.  Cisplatin-
       and paclitaxel-induced apoptosis of ovarian carcinoma cells  and  the
       relationship between bax and bak  up-regulation  and  the  functional
       status of p 53. Mol Pharmacol 1998, 53 (3): 819-26.
       101. Boersma AW, Nooter K, Burger  h,  Kortland  CJ,  Stoter  G.  Bax
       upregulation is an early  event  in  cisplatin-induced  apoptosis  in
       human testicular germ-cell tumor cell line  NT2,  as  quantitated  by
       flow cytometry. Cytometry 1997, 27 (3): 275-82.
       102. Lee JU, Hosotani R,  Wada  H,  Doi  R,  Kosiba  T,  Fujimoto  K,
       Miyamoto Y, Mori C, Nakamura N, Shiota K,  Imamura  M.  Mechanism  of
       apoptosis induced by cisplatin and VP-16 in PANC-1 cells.  Anticancer
       Res 1997, 17 (5A): 3445-50.
       103. Houldsworth J, Xiao H, Murty VV, Chen W, Ray B, Reuter VE,  Bosl
       GJ, Chaganti RS. Human male germ cell tumor resistance  to  cisplatin
       is linked to TP53 gene mutation. Oncogene 1998, 16 (18): 2345-9.
       104. Sakahura C, Sweeney EA, Shirahama T,  Igarashi  Y,  Hakomori  S,
       Tsujimoto H, Imanishi T, Ogaki M, Yamazaki J, Hagiwara  A,  Yamaguchi
       T, Sawai K, Takahashi T.  Overexpression  of  bax  sensitizes  breast
       cancer MCF-7 cells to cisplatin and etoposide. Surg  Today  1997,  27
       (7): 676-9.
       105. Kondo S, Shinomura Y, Kanayama S,  Higashimoto  Y,  Kiyohara  T,
       Zushi S, Kitamura S, Ueyama H, Matsuzawa Y. Modulation  of  apoptosis
       by endogenous Bcl-Xl expression in MKN-45 human gastric cancer cells.
       Oncogene 1998, 17(20): 2585-91.
       106. Nakata B, Muguruma K, Hirakawa K, Chung YS, Yamashita  Y,  Inoue
       T, Matsuoka T, Onoda N, Kato Y, SowaM. Predictive value of Bcl-2  and
       Bax protein expression for chemotherapeutic effect in gastric cancer.
       Apilot study. Oncol 1998, 55(6): 543-7.
       107. Boku N, Chin K, Hosokawa K, Ohtsu A, Tajiri H, Yoshida S,  Yamao
       T, Kondo H, Shirao K, Shimada Y, Saito D, Hasebe T, Mukai K, Seki  S,
       Saito H, Johnston PG. Biological markers as a predictor for  response
       and prognosis of unresectable gastric cancer patients treated with 5-
       fluorouracil and cis-platinum. Clin Cancer Res 1998, 4 (6): 1469-74.
       108. Herod JJ, Eliopoulos AG, Warwick J, Niedobitek G, Young LS, Kerr
       DJ. The prognostic significance of  bcl-2  and  p  53  expression  in
       ovarian carcinoma. Cancer Res 1996, 56 (9): 2178-84.
       109. Muguruma K, Nakata B, Hirakawa K, Yamashita Y, Onoda N, Inoue T,
       Matsuoka T, Kato  Y,  Sowa.  P  53  and  Bax  protein  expression  as
       predictor of chemotherapeutic effect in  gastric  carcinoma.  Gan  To
       Kagaku Ryoho 1998, 3: 400-3.
       110. Ferguson AW,  Flatow U, MacDonald  NJ,   Larminat  F,  Bohr  VA,
       Steeg PS. Increased  sensitivity  to  cisplatin  by  nm23-transfected
       tumor cell lines. Cancer Res  1996; 56: 2931-5.
       111.Masumoto N, Nakaano S. Cell signalling and CDDP  resistance.  Gan
       To Kagaku Ryoho 1997, 24(4): 424-30.
       112. Demidova NS, Ilynskaya GV, Shiryaeva OA, Chernova OB, Goncharova
       SA, Kopnin BP. Decreased  sensitivity  of  multidrug-resistant  tumor
       cells to cisplatin is correlated with sorcin  gene  co-amplification.
       Neoplasma  1995;  42: 195-201.